Интерлейкин 2 при сахарном диабете
-2010/52/1.png "Интерлейкин 2 при сахарном диабете")
Интерлейкин-2 (ИЛ-2) – первый молекулярно-клонированный цитокин, представлялся как важнейший фактор роста Т-клеток, необходимый для их пролиферации и дифференцировки. Последующие исследования показали, что ИЛ-2 способствует генерации, выживаемости и функциональной активности регуляторных Т-клеток Foxp3+ (Treg или Т-супрессоры; Foxp3 – транскрипционный фактор, регулирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов), и в его отсутствие наблюдается глубокий дефицит Т-супрессоров, приводящий к развитию аутоиммунных заболеваний. Таким образом, ИЛ-2 имеет двойные и противоположные функции: поддержание регуляторных Т-клеток и индукция эффекторных клеток, одновременный контроль и стимуляция иммунных реакций.
Самым ранним терапевтическим применением ИЛ-2 была стимуляция иммунного ответа у онкобольных. Не так давно появились терапевтические стратегии использования ИЛ-2, моноклональных антител к нему, или применения химических модификаций ИЛ-2 для увеличения числа и функции клеток Treg с целью лечения аутоиммунных заболеваний. Однако остается актуальной проблема одновременной генерации эффекторных клеток и клеток памяти, естественных киллеров и других лимфоидных популяций при использовании в лечении ИЛ-2.
История
Интерлейкин-2 (ИЛ-2) был выявлен как аутокринный фактор роста для культивируемых Т-клеток и был первым цитокином, клонированным в 1983 году. Вскоре была установлена его роль в стимуляции пролиферации Т-клеток и дифференцировке эффекторных и клеток памяти. Это подтолкнуло к клиническим испытаниям для оценки способности высоких доз ИЛ-2 стимулировать противоопухолевый иммунный ответ у пациентов с меланомой, раком почек и другими опухолями. Фактически, ИЛ-2 был первым биологическим продуктом, полученным с использованием технологии рекомбинантной ДНК, который был введен онкобольным и ВИЧ-инфицированным пациентам для стимуляции Т-клеток и, таким образом, заложил основу одной из великих революций биотехнологии и клинической медицины. Успех ИЛ-2 в качестве иммунотерапии опухолей был ограничен токсичностью, вызванной необходимостью введения высоких доз, проявляющейся как “цитокиновая буря” и синдром капиллярной утечки. Еще одним доказательством роли ИЛ-2 как важного фактора роста Т-клеток in vivo является использование моноклональных антител для подавления отторжения трансплантатов (таких как базиликсимаб, действующее вещество которого блокирует α-субъединицу ИЛ-2 рецепторного комплекса (IL-2Rα, который также известен как CD25 антиген) на поверхности Т-лимфоцитов).
В 1980-х и 1990-х годах в ходе некоторых наблюдений догма об основной роли ИЛ-2 лишь в качестве индуктора активации эффекторных клеток начала подвергаться сомнению. В ходе исследований было установлено быстрое возникновение аутоиммунных реакций на фоне блокирования ИЛ-2 или его рецептора CD25. Эти данные свидетельствовали о том, что значимая функция ИЛ-2 заключается в контроле иммунных реакций и поддержании иммунологической толерантности, а его отсутствие приводит к дефектному контролю эффекторных клеток, что приводит к аутоиммунной агрессии.
Функции и механизмы регуляции интерлейкина-2
ИЛ-2 необходим для выживания и реализации супрессивных функций регуляторных Т-клеток (которые определяются как CD4+, Foxp3+, CD25+, CD127), а отсутствие ИЛ-2 или нарушение его связи с рецептором проявляется численным и/или функциональным дефицитом регуляторных Т-клеток, что является причиной аутоиммунных реакций. Многие экспериментальные подходы показали, что этот цитокин имеет решающее значение для поддержания функционирования клеток Treg: в отсутствие ИЛ-2 T-супрессоры исчезают из периферических лимфоидных органов, по-видимому, потому, что дефицит этого фактора роста приводит к апоптотической гибели клеток.
Так же важна, как роль ИЛ-2 в выживании регуляторных Т-клеток, его необходимость для реализации функциональной мощности клеток Treg. Он необходим для экспрессии Foxp3 и других медиаторов Treg, подавляющих клеточную активность. Стабильная экспрессия Foxp3 реализуется за счет связи с его промотором ИЛ-2-индуцированного транскрипционного фактора 5. Ограниченная доступность ИЛ-2 в тканях, подвергшихся локальному воспалению, может привести к нестабильности клеток Treg, потере экспрессии Foxp3 и последующему производству патогенных цитокинов эффекторными клетками, которые могут усугубить аутоиммунизацию.
Поскольку зрелые клетки Treg не производят ИЛ-2, а он, предположительно, функционирует аутокринно, неизвестен был источник цитокина, который поддерживает на периферии регуляторные Т-клетки. Предполагалось, что стандартные (Foxp3-) Т-клетки продуцируют ИЛ-2, который затем действует на Т-супрессоры. Эта теория была подтверждена исследованиями, проведенными в условиях внутривидовой визуализации и показавшими, что регуляторные и стандартные Т-клетки локализуются вместе с антигенпредставляющими дендритными клетками, и в этих трехклеточных кластерах стандартные клетки реагируют на антиген путем секреции ИЛ-2, тогда как клетки Treg этот цитокин принимают.
Таким образом было установлено, что ИЛ-2 служит, по-видимому, обеим задачам: как стимуляции иммунного ответа, так и его контролю и сдерживанию (рис.1). Интересен вопрос о том, при каких обстоятельствах какая функция доминирует. Одно из предположений заключается в том, что доминирующая функция определяется количеством и кинетикой продукции ИЛ-2: индукция эффекторных клеток в ответ на кратковременное воздействие высоких доз цитокина и регуляторных клеток в ответ на стойкое содержание низкого уровня цитокинов. На активацию различных популяций Т-клеток также влияет кинетика экспрессии интерлейкиновых рецепторов. Рецептор поглощается клеткой после связывания с цитокином, а небольшой пул внутриклеточного IL-2Rβ стандартных CD4+ Т-клеток не позволяет им поддерживать их длительную экспрессию. Регуляторные Т-клетки, напротив, имеют крупные внутриклеточные пулы рецепторных цепей, благодаря чему способны осуществлять их экспрессию и в течение длительного времени могут представлять более устойчивое выделение ИЛ-2, чем другие популяции Т-клеток.
Рис. 1. Двойная роль ИЛ-2 в активации Т-клеток.
ИЛ-2 участвует в индукции иммунных реакций путем стимуляции пролиферации и дифференцировки «обычных» Т-клеток и контроля иммунных реакций за счет поддержания функции регуляторных Т-клеток. Эта двойственная активность, вероятно, различается по кинетике и количеству произведенного ИЛ-2.
MHC – основной комплекс гистосовместимости; TCR – рецептор Т-клеток; APC -антигенпредставляющая клетка.
Наконец, следует упомянуть, что ИЛ-2 осуществляет важные функции по отношению к другим клеткам лимфоидного ряда, включая NK-клетки и лимфоидные клетки врожденного иммунного ответа (рис.2). В одних случаях ИЛ-2 может увеличивать подмножество CD56+ NK-клеток, которые считаются популяцией подавляющей микроокружение опухолей, в других – способствует пролиферации лимфоидных клеток врожденного иммунного ответа (ILC2), способствующим продукции ИЛ-5, что, в свою очередь, приводит к эозинофилии и альтернативной активации макрофов. Кроме того, ИЛ-2 контролирует и другие содержащие CD25+ клетки, необходимые для поддержания тканевого гомеостаза.
Рис. 2. Мишени действия ИЛ-2.
Помимо эффекторных и регуляторных Т-клеток, ИЛ-2 действует на NK-клетки и ILC. ILC2 – лимфоидные клетки врожденного иммунного ответа.
Генетические исследования ИЛ-2
Исследования в области генетики указывают на решающую роль нарушений регуляции ИЛ-2 как фактора риска аутоиммунных заболеваний. Редкие мутации, нарушающие аутокринный механизм регуляции ИЛ-2, могут вызывать тяжелые формы иммунной дисрегуляции. Дефицит IL2RA приводит к хроническому иммунодефициту и развитию IPEX-синдрома (иммуннодисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия и X-связанный синдром) – вариабельным аутоиммунным реакциям, развивающимся в первый год жизни и обусловленными мутацией транскрипционного активатора FOXP3. Мутации в транскрипционных факторах 5B, опосредующих сигналы ИЛ-2, также связаны с первичным иммунодефицитом и переменной аутоиммунизацией, что часто приводит к рецидивирующим инфекциям, экземе, хронической диарее и лимфоидной интерстициальной пневмонии. Варианты мутаций, также связанных с различными аутоиммунными заболеваниями, были обнаружены в генетических локусах, кодирующих ИЛ-2, его рецепторы, и связанные сигнальные факторы (включая 5A/5B и PTPN2).
В локусе гена IL2RA однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП, SNP) влияют на уровни транскрипта IL2RA, растворимость рецептора IL-2RA, его экспрессию на специфические для него типы иммунных клеток и распространенность экспрессирующих IL-2RA Т-клеток в крови.
Недавно разработанное изящное картирование генов (fine mapping) указывает на потенциальные ОНП с улучшенным разрешением. В качестве значимого примера, в локусе IL-2RA был отображен один некодирующий вариант ОНП в первом интроне, ассоциированный с риском болезни Крона. Парадоксально, но тот же ОНП каким-то образом связан с защитой от сахарного диабета 1 типа, что согласуется с ситуационно ограниченными эффектами ИЛ-2, оказывающих диссонансное воздействие на два разных заболевания.
Регулярно сгруппированные короткие палиндромные повторы (CRISPR) продемонстрировали, что изящно картированный IL-2RA вариант с риском аутоиммунизации снижает время индукции IL-2RA в нативных Т-клетках при стимуляции. В будущем такие работы будут иметь потенциал в качестве открытия изменения в ответ на стимуляцию в индукции IL-2RA может изменять риск развития таких заболеваний, как болезнь Крона и сахарный диабет 1 типа. Селективная генная инженерия может быть использована для определения этих связанных с заболеванием вариантов, для оценки механистического воздействия на регуляцию IL-2RA и создания лекарственного средства будущего, работающего непосредственно в отношении затронутых клеточных реакций. Кроме того, CRISPR дает возможность «корректировать» серьезные мутации, которые нарушают сигнализацию IL-2 или переписывать последовательности кодирующих генов, контролирующих специфическую регуляцию сигнальных компонентов ИЛ-2 для генной инженерии в терапии будущего.
Структура ИЛ-2 и его рецептора
ИЛ-2 представляет собой типичный четырех-α-спиральный цитокин, который жестко регулируется на уровне мРНК с помощью сигналов от T-клеточного рецептора и CD28. ИЛ-2 связывается с клеткой через рецепторный комплекс, состоящий из трех субъединиц: IL-2Rα (CD25), IL-2Rβ (CD122) и общей γ-цепи (CD132). Высокое сродство тримерного комплекса IL-2/IL-2Rα/β указывает на его большую стабильность, чем ИЛ-2, связанный либо только с одной цепью α или β. Во время взаимодействия IL-2R тример IL-2/α/β принимает γ-цепь в четвертичный комплекс, что приводит к внутриклеточной передаче сигнала. Поскольку только часть остатка ИЛ-2 взаимодействуют как с цепями β, так и с γc, связывание ИЛ-2 может индуцировать конформационные изменения в β-цепи, что будет способствовать дальнейшему привлечению цепи γc. Для сигнализации необходимы цепочки β и γc, так как α-цепь не участвует в передаче сигналов. В отсутствие экспрессии IL-2Rα, IL-2Rβ и γc могут образовывать промежуточный аффинный рецептор, который полностью компетентен для сигнала. Структура ИЛ-2 и его рецептора является гибкой и может естественным образом существовать в разных конформациях, которые образуют либо высокоаффинный тримерный IL-2R, либо промежуточный аффинный димерный IL-2R, что приводит к активации иммунных клеток.
Рис. 3. Структура комплекса IL-2/IL-2R.
На диаграмме изображено, как цитокин взаимодействует с каждой из трех цепей рецептора.
Терапевтические возможности ИЛ-2
Выяснение роли ИЛ-2 для регуляторных Т-клеток предполагало возможность использования цитокина для борьбы с нежелательным иммунным ответом, а также в лечении аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Задача использования ИЛ-2 для подавления патологических иммунных реакций заключается в том, что цитокин может активировать эффекторную ветвь клеток лимфоидного ряда, тем самым снижая риск обострения болезни. Разрабатывается несколько подходов для таргетирования ИЛ-2 на регуляторные клетки.
Низкодозированный ИЛ-2
Тримерный IL-2Rαβγc обычно экспрессируется в больших количествах клетками Treg, тогда как димерный IL-2Rβγc представляется в основном на активированных CD8+ Т-клетках и NK-клетках. В настоящее время установлено, что терапия низкими дозами ИЛ-2 предпочтительно активирует клетки Treg из-за свойственной им высокой экспрессии IL-2Rα. Первые клинические испытания показали, что низкодозированный ИЛ-2 эффективен при лечении васкулита, ассоциированного с вирусными гепатитами, и хронической реакции трансплантат против хозяина (GVHD). В дальнейшем испытания были проведены в терапии системной красной волчанки и сахарного диабета 1 типа. Результаты до сих пор являются многообещающими, а биологический агент уже одобрен для клинического применения. Однако терапевтическое окно для доз ИЛ-2 слишком мало, что накладывает сложности на применение такого лечения.
Конъюгаты антитело-цитокин
Другим подходом с изменением структуры ИЛ-2 является создание антител к нему, которые при образовании комплексов с цитокином могут стимулировать экспрессию регуляторных или эффекторных Т-клеток. Этот подход был предложен после обнаружения способности цитокина связываться с различными ИЛ-2-антителами, блокирующими на цитокине сайты для связи с β-цепью рецептора и индуцирующими аллостерический эффект, изменяющий связывание цепи IL-2Rα. Экспериментально разработаны ИЛ-2-антитела JES6-1, стерически блокирующие взаимодействие IL-2/IL-2Rβ и IL-2/IL-2Rγ, индуцируя предпочтительную активацию клеток IL-2Rα. Другие антитела к ИЛ-2, S4B6, напротив, изменяют его конформацию приводя к блокировке взаимодействия ИЛ-2/IL-2Rα и стабилизации взаимодействия IL-2/IL-2Rβ, приводящей к избирательному таргетированию эффекторных Т-клеток.
Эти результаты были воспроизведены путем разработки моноклональных антител к ИЛ-2, которые, связываясь цитокином, приводят к его конформационным изменениям, требующим как большей экспрессии CD25, так и меньшего порога для ускорения пролиферации, что реализует усиление активации и увеличение пула клеток Treg. Было показано, что эти антитела/комплексы ИЛ-2 эффективны в моделях таких аутоиммунных заболеваний, как сахарный диабет 1 типа и экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит, а также в модели РТПХ (реакция «трансплантат против хозяина»). Разработка таких препаратов для клинического применения может быть улучшена путем непосредственного связывания антитела с ИЛ-2, в результате чего образуется единый агент, который может увеличивать период полувыведения ИЛ-2 и в то же время ограничивать его нецелевую токсичность.
Химические модификации ИЛ-2
Некоторые усилия были приложены для модификации самого ИЛ-2 с целью улучшения его терапевтического потенциала. Shanafelt и др. генерировали мутеин ИЛ-2 с ~3000-кратной селективностью для Т-клеток, чем для NK-клеток in vitro в сравнении с натуральным цитокином и продемонстрировал его активность in vivo на животных моделях. В 2012 году лаборатория Garcia выпустила CD25-независимую версию ИЛ-2 с повышенной аффинностью связывания с IL-2Rβ, которая показала превосходное сродство с цитотоксическими клетками, что привело к улучшению противоопухолевого ответа. Несколько компаний, в том числе Celgene, Roche, Amgen и другие, разрабатывают новые ИЛ-2 мутеин, которые преимущественно вызывают прирост эффекторных или регуляторных Т-клеток. Эти аналоги ИЛ-2 действуют как частичные агонисты и по-разному влияют на те или иные популяции лимфоцитов.
Другие подходы к повышению эффективности ИЛ-2 состоят в соединении цитокина с крупными молекулами-переносчиками, такими как альбумин или полиэтиленгликоль (ПЭГ), или с генетическим слиянием ИЛ-2 с Fc (кристаллизующийся фрагмент) иммуноглобулина. В настоящее время ведется разработка ПЭГилированного ИЛ-2 от Nektar Therapeutics с пониженной аффинностью к тримерному IL-2R регуляторных Т-клеток, который в большей степени поддерживает цитотоксические CD8+ клетки, обеспечивая выраженную противоопухолевую активность.
Клеточная терапия ИЛ-2
Потенциал влияния ИЛ-2 на отдельные подтипы T-клеток или NK-клеток может быть использован для создания цитокиновой системы, в которой пара рецептор-лиганд ограничена исключительно совместным взаимодействием. Генно-инженерные Т-клетки могут экспрессировать мутантную версию IL-2Rβ, на которую будет избирательно влиять специфический мутантный ИЛ-2. Это повышает вероятность выборочного влияния на отдельные популяции Т-клеток и, следовательно, в перспективе может использоваться для лечения как аутоиммунных, так и онкозаболеваний.
Выводы
История ИЛ-2 дает замечательные уроки о том, как концепции полностью меняются в ходе тщательных научных изысканий. Долгие годы ИЛ-2 считался основным фактором роста Т-клеток и был вовлечен в инициирование иммунных реакций. Более свежие результаты от разнообразных экспериментальных подходов предполагают, что основная функция ИЛ-2 заключается в поддержании стабильной работы регуляторных T-клеток в лимфоидных органах и тканях. Эти новые разработки и пересмотр взгляда на биологию ИЛ-2 стали основой новых терапевтических стратегий, использующих этот цитокин для подавления, а не для стимуляции иммунных реакций. Конечно, многое еще предстоит изучить, чтобы реализовать весь его потенциал: следует учитывать способность ИЛ-2 воздействовать на различные популяции клеток, многие из которых могут способствовать воспалительным реакциям и, таким образом, служить риском развития аутоиммунных заболеваний. Достижение оптимального баланса между активацией эффекторных и регуляторных Т-клеток также остается постоянной проблемой в терапевтическом применении этого цитокина. Однако многие текущие клинические разработки должны решить эти проблемы в ближайшем будущем.
Нашли опечатку? Выделите фрагмент и нажмите Ctrl+Enter.
Введение
Актуальность профилактики хирургической инфекции определяется высокой частотой инфекционных осложнений послеоперационного периода. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), в 1995 г. у 30 % оперированных больных развивались осложнения, вызванные госпитальной инфекцией [1]. В настоящее время в хирургических стационарах г. Москвы гнойносептические осложнения составляют от 7,1 до 27,8 % (ГВМУ МО РФ, РАСХИ, 2004).
Традиционным и наиболее распространенным методом профилактики послеоперационной инфекции является предоперационное введение антибиотиков [2]. Эффективность антибиотикопрофилактики постепенно снижается изза увеличения антибиотикорезистентных штаммов патогенных микроорганизмов, увеличения доли больных преклонного возраста, пациентов с иммунодефицитом [3].
Среди причин развития инфекционных осложнений в послеоперационном периоде одно из главных мест занимает нарушение функционирования системы иммунитета [4]. Вторичный иммунодефицит также характерен для больных сахарным диабетом (СД). По этой причине сахарный диабет включен ВОЗ в классификацию болезней, приводящих к развитию вторичного иммунодефицита. Проблема актуальна тем, что количество больных СД в мире только на сегодняшний день составляет более 285 млн, а к 2025 г. их количество возрастет до 380 млн, что составит около 7,1 % от всего взрослого населения планеты. Увеличивающееся число больных, страдающих СД, и сопутствующая этому заболеванию иммуносупрессия обусловливают увеличение частоты послеоперационных инфекционных осложнений, несмотря на существующие меры антибиотикопрофилактики хирургических инфекций [5]. Несмотря на успехи современной эндокринологии и хирургии, число послеоперационных осложнений в этой группе достигает 30-37 %. Расшифровка процесса клеточного и гуморального иммунитета позволила выявить механизмы работы антимикробной защиты человека. Важным компонентом этих механизмов являются цитокины, которые оказались неотъемлемыми модуляторами иммунного ответа.
Одним из наиболее важных и изученных цитокинов, участвующих в процессе развития и усиления иммунного ответа, является интерлейкин2. Многогранность биологической активности интерлейкина2 позволяет при его применении в качестве иммуномодулятора рассчитывать не только на коррекцию проявлений иммунной недостаточности, но и на оптимизацию функционирования всей системы иммунитета и адекватное ее взаимодействие с другими системами организма. Широкий спектр биологических эффектов интерлейкина2 объясняет повышенное внимание специалистов к рекомбинантным препаратам этого цитокина как потенциальным средствам иммунотерапии различных вариантов вторичной иммунной недостаточности. Наше внимание привлек отечественный препарат рекомбинантного интерлейкина2 – ронколейкин, выделенного из клеток продуцента – рекомбинантного штамма непатогенных пекарских дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae. Ронколейкин – полный структурный и функциональный аналог эндогенного интерлейкина2, обладающий тем же спектром функциональной активности. Препарат включен в Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система) МЗ РФ. Препарат успешно прошел клинические испытания и используется в комплексном лечении различных патологических процессов.
Однако информации о применении ронколейкина в качестве средства профилактики послеоперационной инфекции у больных СД при ампутации конечности на уровне бедра в доступной литературе найдено не было. Все это послужило основанием для настоящего исследования.
Цель исследования – улучшить результаты хирургического лечения при ампутации нижних конечностей на уровне бедра у больных сахарным диабетом, используя препарат рекомбинантного интерлейкина2 ронколейкин в целях иммунопрофилактики.
Материал и методы исследования
На первом этапе исследования для выявления факторов, способствующих развитию инфекционных осложнений в послеоперационном периоде у больных СД 2го типа, анализировались результаты лечения 67 больных. В группу включались все больные, которым выполнялась ампутация на уровне бедра по поводу гнойновоспалительных заболеваний нижних конечностей на фоне диабетической ангиопатии сосудов нижних конечностей (табл. 1).
Всем больным проводилась традиционная предоперационная антибиотикопрофилактика цефазолином в дозе 2 г внутримышечно за 1 ч до операции. Выбор антибиотика и схема профилактики были регламентированы внутрибольничным формуляром антибиотикопрофилактики и рекомендациями межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии и научнометодического центра Минздрава России по мониторингу антибиотикорезистентности 2005 г. В процессе исследования любые другие антибактериальные средства или препараты иммуноориентированной терапии не использовались. У пациентов оценивались частота возникновения инфекционных послеоперационных осложнений в зависимости от тяжести состояния, массы тела больного, наличия сопутствующей патологии, а также от степени декомпенсации сахарного диабета, длительности предоперационного нахождения в стационаре, наличия и выраженности иммунодефицита.
Ампутация нижней конечности на уровне бедра проводилась с выкраиванием кожных, фасциальных лоскутов и пересечением мышц у основания этих лоскутов. Во всех случаях использовалась спинномозговая анестезия. Рана ушивалась наглухо с оставлением в подкожной клетчатке на 2 сут. дренажа по Редону для активной аспирации раневого отделяемого. Дренаж удаляли на 2е сутки после операции. При удалении из дренажа раневое отделяемое в количестве около 3 мл собирали в пробирку. В клинической лаборатории делали мазки, просматривали под микроскопом, подсчитывали клеточные элементы, микрофлору. Для бактериологического исследования использовали свободный участок дренажа, находившийся в полости раны. Швы снимались на 8-9е сутки.
При повышении температуры тела, появлении отека, гиперемии кожи культи, гнойного отделяемого из раны регистрировалась инфекция области оперативного вмешательства. Появление у больного кашля, развитие или нарастание одышки, повышение температуры тела, наличие свежих инфильтративных изменений при рентгенографии в легких были диагностическими критериями развития пневмонии в послеоперационном периоде.
После уточнения факторов, способствующих развитию послеоперационных инфекционных осложнений, оценивалась эффективность иммунопрофилактики послеоперационной хирургической инфекции препаратом рекомбинантного интерлейкина2 – ронколейкином с использованием метода подкожного введения. Проведено исследование, в которое были включены 60 больных (42 женщины и 18 мужчин) от 55 до 75 лет с СД 2го типа, которым предстояла ампутация на уровне бедра по поводу гнойносептических заболеваний дистальных отделов конечностей. Больные были распределены в две группы. Группы были сопоставимы по длительности заболевания СД, полу, возрасту, наличию сопутствующих заболеваний.
В контрольной группе (30 больных) предоперационная профилактика инфекции проводилась по традиционной схеме: за 1 ч до ампутации вводили цефазолин в дозе 2 г внутримышечно. Основной группе (30 больных) профилактика инфекции осуществлялась введением за 1 ч до ампутации цефазолина в дозе 2 г внутримышечно и, кроме того, ронколейкина в дозе 0,5 мг (500 000 ME – 250 000 МЕ в бедро и живот) подкожно в смеси с 2 мл изотонического раствора хлорида натрия в одном шприце. В послеоперационном периоде у больных основной группы продолжалось введение ронколейкина: вторая инъекция 0,5 млн ЕД ронколейкина – через 48 ч после завершения операции, третья инъекция 0,5 млн ЕД ронколейкина – на 5е сутки послеоперационного периода подкожно (по 250 000 МЕ в бедро и живот) в смеси с 2 мл изотонического раствора хлорида натрия в одном шприце.
Результаты, полученные при исследованиях, обработаны вариационностатистическим методом по tкритерию Стьюдента. Различие считали статистически достоверным, если уровень значимости был p < 0,05, что является мерой достаточной надежности результатов в медицине. Расчеты произведены на персональном компьютере с использованием статистической программы Exсel.
Результаты исследования и их обсуждение
При оценке результатов лечения 67 пациентов, страдающих СД 2го типа, после ампутации нижней конечности на уровне бедра по поводу гнойновоспалительных заболеваний конечностей отмечено развитие инфекционных послеоперационных осложнений у 14 (21 %) больных.
При сопоставлении особенностей течения послеоперационного периода и данных предоперационного обследования установлено, что фактором, способствующим развитию инфекций области оперативного вмешательства у больных СД 2го типа после ампутации нижних конечностей на уровне бедра, является наличие гипертонической болезни III стадии, ожирения II и более стадии. У 44 % больных с индексом массы тела (ИМТ) 40 кг/м2 и более развивалось нагноение культи в послеоперационном периоде. Вероятно, это связано с тем, что выполнение ампутации при морбидном ожирении сопровождается техническими сложностями, что способствует образованию и затрудняет своевременную диагностику подкожных гематом, сером области операционной раны.
Развитие пневмоний у трети больных с ИМТ 40 кг/м2 и более связано с ограничением подвижности пациентов в пределах постели, усугублением течения сопутствующей патологии. В развитии послеоперационной пневмонии играют роль сопутствующая гипертоническая болезнь III стадии, фактор курения, ограничение подвижности изза заболеваний нервной системы, суставов. Курение способствует увеличению частоты развития пневмоний в послеоперационном периоде (16,6 % у курящих против 7,2 % у некурящих).
В развитии местных и висцеральных инфекционных осложнений послеоперационного периода важными являются длительность предоперационного пребывания больных в стационаре (нахождение в стационаре до операции более 4 сут.), общее состояние больных средней и более степени тяжести. Инфекционные осложнения в послеоперационном периоде развились у 30,7 % (9) больных среди пациентов с тяжелым общим состоянием до операции. Из больных с состоянием средней степени тяжести осложненное инфекцией течение послеоперационного периода развилось у 4 (10,5 %) пациентов.
Одним из ведущих факторов в развитии послеоперационных инфекционных осложнений было наличие декомпенсированного СД. Инфекция послеоперационного периода развилась у 80 % больных с декомпенсированным СД. В том числе инфекция области оперативного вмешательства возникала у 40 % пациентов с декомпенсированным течением СД.
В то же время нагноение культи у больных с компенсированным СД отмечалось лишь в 7 % случаев. Это обстоятельство связано с выраженной иммуносупрессией у пациентов с декомпенсированным СД. При анализе показателей иммунограмм у таких больных в популяционном составе лимфоцитов отмечены изменения, характеризующие существенные нарушения в иммунной системе. Статистически достоверно сниженным (р < 0,05) было относительное и абсолютное содержание зрелых Тлимфоцитов, Тхелперов у пациентов с декомпенсированным СД, а также уменьшение показателя абсолютных значений Тцитотоксических лимфоцитов. Отмечается угнетение факторов неспецифического иммунитета. Достоверно (р < 0,05) снижено значение фагоцитарного показателя у больных с декомпенсированным СД.
Показатели иммуноглобулинов были в пределах нормы, что обусловлено преимущественным поражением Тклеточного иммунитета. При анализе иммунограмм важно отметить статистически достоверно сниженное (р < 0,05) абсолютное содержание зрелых Тлифоцитов у больных с развившимися в дальнейшем послеоперационными инфекционными осложнениями по сравнению с пациентами с неосложненным течением послеоперационного периода.
При анализе цитограмм раневого отделяемого на 2е сутки послеоперационного периода не удалось выявить какихлибо закономерностей между количеством и процентным соотношением клеточных элементов и частотой нагноения ран в послеоперационном периоде.
У 29 (43 %) из 67 пациентов микрофлоры в мазках обнаружено не было. У остальных 38 (57 %) в мазках выявлены микроорганизмы. Их них у 32 (48 %) больных в цитограммах отмечено от 0 до 10 микробных клеток в поле зрения и у 6 (9 %) пациентов количество микробов в мазках было от 10 до 100 микробных клеток в поле зрения.
Использование микроскопии осадка раневого отделяемого культи на 2е сутки после операции позволяет прогнозировать нагноение раны в послеоперационном периоде.
При бактериологическом исследовании кусочков дренажей, удаленных на 2е сутки послеоперационного периода, рост микрофлоры обнаруживался в 34 % случаев (23 больных от общего числа пациентов). Следует отметить, что положительные бактериологические посевы на 2е сутки после операции в 35 % случаев соответствовали нагноению раны культи на 5-8е сутки послеоперационного периода. Наличие развернутого микробиологического анализа возбудителей к 7м суткам послеоперационного периода помогает в подборе антибиотиков для лечения развившегося нагноения операционной раны.
Таким образом, анализируя полученные данные, можно сделать вывод, что перечисленные факторы риска, особенно декомпенсированное течение СД, ведут к увеличению числа послеоперационных инфекционных осложнений. Заметим, что ведущую роль здесь играет угнетение иммунитета. По этой причине введение в схему профилактики хирургической инфекции препарата интерлейкина2 наиболее оправданно. Ронколейкин достаточно быстро корректирует иммунологические изменения, поэтому он был дополнительно введен в традиционную схему антибиотикопрофилактики перед операцией. Препарат рекомбинантного интерлейкина2 (ронколейкин) во всех случаях вводился по единой методике подкожно. Частота послеоперационных инфекционных осложнений в группе больных, которые получали иммунопрофилактику препаратом ронколейкин, составила 3,3 % (нагноение послеоперационной раны у 1 больного) против 20 % осложненного инфекцией послеоперационного течения у пациентов контрольной группы.
Висцеральных послеоперационных инфекционных осложнений у больных основной группы не было.
Отмечалось уменьшение длительности нахождения в стационаре больных основной группы в среднем на 8,4 ± 0,9 сут., что связано с меньшим количеством инфекционных осложнений в группе. Обращает на себя тенденция к более быстрой нормализации общего самочувствия у больных, получавших иммунопрофилактику. На введение ронколейкина ожидалось появление изменений в показателях иммунитета.
Следует отметить статистически достоверное (р < 0,05) увеличение лимфоцитов в основной группе по сравнению с контрольной, что обусловлено иммуностимулирующим действием интерлейкина2. В результате применения ронколейкина увеличилось количество преимущественно популяции Тклеточного звена иммунитета.
Наблюдался прирост количества Влимфоцитов как результат активизации Тклеточного звена иммунитета. Достоверно (р < 0,05) увеличилось абсолютное количество Влимфоцитов в основной группе к 7м суткам послеоперационного периода по сравнению с контрольной группой. Отмечено статистически незначимое (р > 0,05) увеличение уровня иммуноглобулинов к 7м суткам послеоперационного периода у больных, получавших ронколейкин, по сравнению с больными контрольной группы.
У больных, получавших иммунопрофилактику, отмечается увеличение показателей факторов неспецифического иммунитета: статистически достоверно (р < 0,05) увеличились значения показателей фагоцитарного числа и фагоцитарного показателя к 7м суткам послеоперационного периода по сравнению с показателями дооперационного периода.
Статистически достоверно (р < 0,05) более высокие значения показателей относительного и абсолютного содержания зрелых Тлимфоцитов, Тхелперов в основной группе к 7м суткам послеоперационного периода по сравнению с контрольной группой.
В цитограммах раневого отделяемого у 13 (43 %) больных основной группы и у 16 (53 %) контрольной группы на 2е сутки после операции обнаруживалась смешанная микрофлора. Цитограммы с количеством микрофлоры от 0 до 10 микробных клеток в поле зрения были у 11 (36 %) больных основной группы и у 13 (43 %) пациентов контрольной.
Цитограммы с количеством микрофлоры от 10 до 100 микробных клеток в поле зрения были у 2 (7 %) больных основной группы и у 3 (10 %) пациентов контрольной группы. Заметим, что при таком количестве микрофлоры нагноение послеоперационной раны развилось у 1 больного основной группы и у 2 контрольной группы.
Бактериологическое исследование дренажей, удаленных на 2е сутки послеоперационного периода, выявило рост микрофлоры в основной группе у 8 (27 %) больных и у 9 (30 %) – в контрольной.
Необходимо подчеркнуть, что инфекция области оперативного вмешательства развилась только у 1 (12,5 %) больного основной группы из 8 положительных бактериологических посевов. В то же время нагноение культи в контрольной группе развилось у 3 (33 %) больных из 9 посевов с ростом микрофлоры. На основании полученных данных можно говорить об уменьшении числа нагноения ран у больных, получавших иммунопрофилактику ронколейкином.
Следует отметить, что тяжелых нежелательных реакций на введение ронколейкина зарегистрировано не было.
Таким образом, применение ронколейкина у больных сахарным диабетом при ампутации на уровне бедра по поводу гнойнонекротических заболеваний нижних конечностей приводит к коррекции нарушений иммунитета и, как следствие, к снижению числа осложнений инфекционного характера в послеоперационном периоде, сокращению сроков лечения больных. Ронколейкин является безопасным и удобным лекарственным средством.
Иммунопрофилактика с использованием метода подкожного введения ронколейкина у больных сахарным диабетом при ампутации ни?