На крысах диабета 2 типа

Characterization of the Prediabetic State in a Novel Rat Model of Type 2 Diabetes, the ZFDM Rat
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4415487/

Akanishi c hi r: Казуя Ямагата

Недавно мы создали новую модель для животных с ожирением диабетом типа 2 (T2D), штаммом крысы жирного сахарного диабета Zucker (ZFDM), несущим живую мутацию (fa) в гене рецептора лептина. Здесь мы выполнили фенотипическую характеристику штамма, фокусируясь в основном на преддиабетическом состоянии. В возрасте 6-8 недель у самцов крыс fa / fa проявлялась мягкая непереносимость глюкозы и сильная резистентность к инсулину. Хотя базальная секреция инсулина была значительно выше в изолированных островках поджелудочной железы, реакции на стимуляцию глюкозы и инкретин GLP-1 сохранялись. В возрасте 10-12 недель у самцов крыс fa / fa проявлялась выраженная непереносимость глюкозы, а также сильная резистентность к инсулину, сходная с таковой в более раннем возрасте. В остриях поджелудочной железы сохранялся секреторный ответ инсулина на стимуляцию глюкозы, но реакция на инкретин уменьшалась. У недиабетических жирных крыс Zucker (ZF), секреторные реакции инсулина как на стимуляцию глюкозы, так и на инкретин в остриях поджелудочной железы были аналогичны ответам крыс ZFDM. Поскольку островковая архитектура была разрушена с возрастом у крыс ZFDM, сочетание тяжелой резистентности к инсулину, уменьшенный секреторный ответ инсулина на инкретин и внутренняя хрупкость островков могут вызвать развитие T2D в этом штамме.

Диабет 2 типа (T2D) является наиболее распространенной формой диабета, поражающей более 80% всех людей с этим заболеванием. T2D является метаболическим расстройством, характеризующимся хронической гипергликемией, обусловленной резистентностью к инсулину и / или нарушенной секрецией инсулина. Несмотря на увеличение заболеваемости и распространенности Т2Д, мало известно об эффективном лечении и профилактике заболевания и его осложнениях на ранних стадиях.

Спонтанные модели животных внесли большой вклад в изучение T2D. Существует несколько полезных моделей крыс, таких как крыса Goto-Kakizaki (GK) [1], жирная крыса Wistar [2], крысиная диабетическая жирная крыса Zucker (ZDF) [3], крыса Otsuka Long-Evans Tokushima fatty (OLETF) [4 ] и Spontaneous Diabetic Torii (SDT) [5]. Спонтанные модели позволяют сравнивать нормогликемические, преддиабетические и диабетические состояния за ограниченный период времени и особенно полезны при изучении механистических, патофизиологических и профилактических аспектов T2D. Только некоторые из этих моделей широко подходят для использования в этих исследованиях, включая ZDF и SDT-крысу.

Недавно мы установили новую модель крыс тучной T2D, крысиную жирную сахарную клетку Цукера (ZFDM), содержащую жировую мутацию (fa) в гене рецептора лептина. крысы крысы fa / fa поддерживают нормогликемическое состояние до 7-недельного возраста, а затем развивают диабет уже в возрасте 10 недель, достигая 100% заболеваемости в возрасте около 20 недель [6]. В отличие от исходной крысы Zucker fatty (ZF) [7], жирная крыса Wistar и крыса ZDF крысы крыс fa / fa в штамме ZFDM являются фертильными и обладают высокой репродуктивной эффективностью. Поэтому ZFDM-крысы могут служить полезной моделью T2D.

Здесь мы провели фенотипическую характеристику штамма ZFDM, фокусируясь в основном на преддиабетическом состоянии. Мы также характеризовали секреторные реакции инсулина как на стимуляцию глюкозы, так и на инкретин GLP-1 в изолированных островках поджелудочной железы. Кроме того, мы сравнили эти характеристики крыс ZFDM с таковыми у оригинальных крыс ZF.

Самцы крыс ZFDM (Hos: ZFDM-Lepr
fa, fa / fa и fa / +) были предоставлены Hoshino Laboratory Animals, Inc. (Ибараки, Япония). Самцы ZF-крыс (Slc: Zucker, fa / fa и + / +) были приобретены в Японии SLC, Inc. (Хамамацу, Япония). Все животные поддерживались в особых условиях без патогенов с 12-часовым темно-темным циклом и получали коммерческую диету CE-2 (CLEA Japan, Inc., Токио, Япония) на объекте Animal Facility of Kobe Biotechnology Research and Human Resource Development Центр Кобеского университета. Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментам на животных Университета Кобе и проводились в соответствии с Руководством по экспериментам на животных в Университете Кобе.

Глюкозу (2,0 г / кг массы тела) вводили перорально 6 ч голодным крысам. Образцы крови собирали из хвостовой вены в указанные моменты времени. Уровни глюкозы в крови измеряли с помощью переносного глюкометра (ANTSENSE III, HORIBA, Ltd., Киото, Япония), а уровни инсулина в плазме измеряли с помощью набора ELISA для инсулина (Shibayagi Co., Ltd., Gunma, Japan).

Инсулин (1,0 МЕ / кг массы тела) (Humulin R, Eli Lilly Japan K.K., Kobe, Japan) вводили подкожно до 6 ч голодных крыс. Образцы крови собирали из хвостовой вены в указанные моменты времени. Уровни глюкозы в крови измеряли переносным глюкометром (ANTSENSE III).

Островки поджелудочной железы были выделены путем расщепления коллагеназой и градиентом Ficoll [8, 9]. Изолированные островки поджелудочной железы культивировали в течение 3 дней в RPMI1640, предварительно инкубировали в течение 30 мин в H-KRB с 2,8 мМ глюкозы и затем инкубировали в течение 30 мин в H-KRB с 11,1 мМ глюкозы в присутствии или в отсутствие 10 нМ GLP-1. Инсулин, высвобождаемый в инкубационном буфере, и содержание клеточного инсулина в остриях поджелудочной железы измеряли с помощью наборов для анализа инсулина из CIS Bio international (Gif sur Yvette, France). Количество секреции инсулина нормализовалось по содержанию клеточного инсулина, определяемому 0,1% экстракцией Triton X-100.

Гистологический анализ поджелудочной железы проводили с использованием процедур, как описано ранее [10]. Вкратце, поджелудочная железа была зафиксирована в 10% нейтральном буферном формалине. Фиксированные образцы встраивали в парафин, разделяли на 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином для гистопатологического исследования.

Данные выражаются как среднее ± SEM. Различия в уровне глюкозы в крови и уровне инсулина в плазме оценивали с использованием t-тестов Уэлша. Различия в секреции инсулина с островков поджелудочной железы оценивали с использованием метода Туки-Крамера. Различия, для которых значение Р было

Чтобы охарактеризовать толерантность к глюкозе у крыс ZFDM в преддиабетическом состоянии, мы провели OGTT в возрасте 6-8 недель и в возрасте 10-12 недель. В возрасте 7 недель у крыс крыс fa / fa наблюдалась умеренная, но значительная непереносимость глюкозы после пероральной нагрузки на глюкозу (рис. 1 (а)). Через 120 мин после загрузки глюкозы уровни глюкозы в крови крыс fa / fa уменьшались до уровней глюкозы натощак. Уровни плазменного инсулина крыс fa / fa были значительно выше в состоянии голодания (0 мин), чем у крыс fa / + (рис. 1 (b)). Различия в уровнях инсулина были более очевидными после загрузки глюкозы.

В возрасте 11 недель крысы fa / fa проявляли выраженную непереносимость глюкозы во всех временных точках, исследованных после загрузки глюкозы (рис. 1 (c)). Уровни глюкозы в крови крыс fa / fa уменьшались, но не до уровня глюкозы натощак через 120 мин после загрузки глюкозы. Уровни плазменного инсулина крыс fa / fa были значительно выше, чем у крыс fa / + в состоянии голодания (0 мин) и после загрузки глюкозы (рис. 1 (d)). Эти результаты указывают на мягкую непереносимость глюкозы у крыс fa / fa в возрасте 7 недель и дальнейшее ухудшение с возрастом.

Чтобы охарактеризовать чувствительность к инсулину крыс ZFDM в преддиабетическом состоянии, мы выполнили ITT в возрасте 7 и 11 недель. крысы fa / fa в обоих возрастных группах проявляли сильную резистентность к инсулину (фиг. 2 (a) и 2 (b)). Не было очевидной разницы в степени резистентности к инсулину в возрасте 7 и 11 недель. Эти результаты указывают на сильную резистентность к инсулину у крыс fa / fa уже через 7 недель, которая остается с возрастом.

Чтобы сравнить особенности толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину крыс ZFDM с крысами недиабетических крыс ZF, мы провели OGTT и ITT на крысах ZF в возрасте 12 недель. У крыс ZF fa / fa наблюдалась умеренная, но значительная непереносимость глюкозы после загрузки глюкозы (рис. 3 (а)). В отличие от крыс ZFDM fa / fa уровни глюкозы в крови крыс ZF fa / fa уменьшались до уровней глюкозы натощак через 120 мин после загрузки глюкозы. Уровни плазменного инсулина крыс ZF fa / fa были значительно выше в состоянии голодания (0 мин), чем у крыс + / + (рис. 3 (б)). После загрузки глюкозы уровни инсулина крыс ZF fa / fa были значительно увеличены и были значительно выше, чем у крыс ZFDM fa / fa (рис. 3 (d)). Эти данные показывают, что крысы fa / fa в штамме ZF могут поддерживать состояние мягкой непереносимости глюкозы за счет увеличения секреции инсулина, тогда как крысы fa / fa в штамме ZFDM не могут из-за дефектов в секреции инсулина.

У крыс ZF fa / fa наблюдалась сильная резистентность к инсулину, что было оценено ITT (рисунок 3 (c)). Не было очевидной разницы в степени резистентности к инсулину у крыс fa / fa между штаммами ZFDM и ZF. Эти результаты свидетельствуют о сходном состоянии тяжелой резистентности к инсулину у крыс fa / fa в обоих штаммах.

Чтобы прояснить секреторные реакции инсулина как на стимуляцию глюкозы, так и на инкретин GLP-1 в островках поджелудочной железы крыс ZFDM в преддиабетическом состоянии, мы провели эксперименты по инкубации с использованием изолированных островков поджелудочной железы в возрасте 7 и 11 недель. Хотя базальная секреция инсулина из островков поджелудочной железы крыс fa / fa была значительно выше, чем у крыс fa / + в возрасте 7 недель (фиг.4 (a) и 4 (b)), секреторные реакции инсулина как на стимуляцию глюкозы, так и на инкретин были сохранены у крыс fa / fa. В возрасте 11 недель секреторный ответ инсулина на стимуляцию глюкозы поддерживался, но что инкретин был чрезвычайно уменьшен у крыс fa / fa (рис. 4 (c) и 4 (d)). Подобные секреторные реакции инсулина наблюдались у крыс fa / fa в недиабетической штамме ZF (рисунки 4 (e) и 4 (f)). Эти данные показывают, что дефекты секреции инсулина из островков поджелудочной железы распространены у крыс fa / fa обоих штаммов.

Для выяснения гистологических изменений поджелудочной железы крыс ZFDM в преддиабетическом состоянии мы провели гистологическую характеристику поджелудочной железы в возрасте 7, 12 и 20 недель. Не было обнаружено явных патологических изменений эндокринной и экзокринной поджелудочной железы крыс fa / + (рис. 5 (a), 5 (b), 5 (g), 5 (h), 5 (m) и 5 ​​(n)). У крыс fa / fa увеличенные островки поджелудочной железы наблюдались в возрасте 7 недель (рис. 5 (c) и 5 ​​(d)), а островковая архитектура была разрушена с возрастом (рис. 5 (i), 5 (j), 5 ( o) и 5 ​​(p)). Напротив, архитектура островков была существенно сохранена с возрастом у крыс fa / fa в штамме ZF (фиг.5 (e), 5 (f), 5 (k), 5 (l), 5 (q) и 5 ​​(r )).

В этом исследовании мы охарактеризовали преддиабетическое состояние штамма ZFDM. В период с 7-летнего возраста у крыс fa / fa существует мягкая непереносимость глюкозы и с возрастом ухудшается. Напротив, тяжелая инсулинорезистентность уже существует у крыс крыс fa / fa в возрасте 7 недель и остается тяжелой с возрастом. В остриях поджелудочной железы сохраняется секреторный ответ инсулина на стимуляцию глюкозы, но с увеличением инкретина GLP-1 уменьшается с возрастом. Напротив, крысы fa / fa в недиабетическом штамме ZF поддерживают умеренную непереносимость глюкозы за счет увеличения секреции инсулина с возрастом. Однако дефект секреторного ответа инсулина на инкретин является обычным для крыс обоих штаммов. Эти данные вместе показывают, что в дополнение к тяжелой резистентности к инсулину и уменьшению реакции инсулина на инкретин, другие дефекты участвуют в развитии T2D у крыс ZFDM.

В штамме ZFDM крысы fa / fa демонстрируют увеличенные островки поджелудочной железы в возрасте 7 недель, что компенсирует увеличение спроса на инсулин из-за сильной резистентности к инсулину. Однако, островковая архитектура разрушается с возрастом, что приводит к относительной недостаточности инсулина. Напротив, крысы fa / fa в штамме ZF поддерживают увеличенные островки поджелудочной железы и архитектуру с возрастом, что компенсирует сильную резистентность к инсулину для поддержания нормогликемии. Эти данные свидетельствуют о том, что высокая степень хрупкости островков является неотъемлемой частью крыс fa / fa в штамме ZFDM. ZFDM fa / fa крысы не могут компенсировать серьезную резистентность к инсулину, что приводит к развитию диабета.

Сообщалось, что β-клеточная масса у крыс преддиабетических крыс ZDF fa / fa у 5-7-недельных пациентов аналогична таковой у взрослых крыс ZF fa / fa и выше, чем у крыс Zucker lean (+ /?) [11]. В возрасте 12 недель (после начала диабета) β-клеточная масса у крыс ZDF fa / fa была ниже, чем у крыс ZF fa / fa. Считалось, что отказ β-клеточного расширения объясняется увеличением скорости гибели клеток [11]. В другом докладе [12] масса β-клеток была уменьшена на 51% от 8 до 12 недель у крыс ZDF fa / fa. Увеличение смертности β-клеток хорошо коррелировало с увеличением уровней глюкозы в плазме, что свидетельствует о том, что гипергликемия у крыс ZDF развивается одновременно с увеличением чистой гибели β-клеток. Несмотря на задержку начала диабета, подобное изменение массы β-клеток может происходить у крыс ZFDM fa / fa.

Мы обнаружили снижение реакции инсулина на инкретин GLP-1 не только в ZFDM fa / fa, но и в ZF fa / fa островках в возрасте 12 недель, что указывает на общий дефект в островках поджелудочной железы обоих штаммов. В подтверждение этого открытия было обнаружено несколько патологических особенностей в островках ZF fa / fa в возрасте 14 недель, таких как вакуолизация β-клеток, застой крови сосудов, кровоизлияние, фиброз и минимальная инфильтрация мононуклеарных клеток [13]. Эти патологические изменения могут влиять на нормальную функцию островков, в том числе на инкретину, индуцированную секрецией инсулина. В дополнение к относительно крупным островкам, на которых приходится большая часть популяции островков, на 11-недельных крысах fa / fa обоих штаммов имеются относительно небольшие и морфологически нормальные островки. Секреторные реакции инсулина как на стимуляцию глюкозы, так и на инкретин были сохранены в этих маленьких островках (данные не показаны), что также подтверждает корреляцию между патологическими изменениями в островках поджелудочной железы и уменьшением реакции инсулина на инкретину.

В этом исследовании мы охарактеризовали преддиабетическое состояние новой модели животного тучного T2D, штамма ZFDM. В дополнение к тяжелой резистентности к инсулину и уменьшению реакции инсулина на инкретин, внутренняя хрупкость островков у крыс ZFDM может способствовать развитию T2D в этом штамме. Штамм ZFDM должен быть полезен для изучения механизмов инкретин-индуцированной секреции инсулина и хрупкости островков в патогенезе T2D.

Авторы выражают признательность и благодарность всем коллегам в своих лабораториях. Это исследование было поддержано грантами в области научных исследований Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии.

Йошикадзу Хосино и Масаюки Хосино являются сотрудником и президентом Hoshino Laboratory Animals, Inc., соответственно, компанией, предоставляющей Hos: ZFDM-Lepr
фа-крыс.

Характеристика толерантности к глюкозе штамма ZFDM. (а) уровни глюкозы в крови и (б) уровни инсулина в плазме во время OGTT в возрасте 7 недель. (c) Уровни глюкозы в крови и (d) уровни инсулина в плазме во время OGTT в возрасте 11 недель. Данные выражаются как среднее ± SEM. Т-критерий Уэлша использовался для сравнения между крысами fa / fa (красный, n = 6) и fa / + (синий, n = 6).

Характеристика чувствительности к инсулину штамма ZFDM. Уровни уровня глюкозы в крови во время ITT (a) 7 и (b) 11 недель. Данные выражаются как среднее ± SEM. Т-критерий Уэлша использовался для сравнения между крысами fa / fa (красный, n = 6) и fa / + (синий, n = 6).

Характеристика толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину штамма ZF. (а) уровни глюкозы в крови и (б) уровни инсулина в плазме во время OGTT в возрасте 12 недель. (c) Уровни глюкозы в крови во время ITT в возрасте 12 недель. (d) данные AUC по секреции инсулина во время OGTT в штаммах ZF и ZFDM. Данные выражаются как среднее ± SEM. Т-критерий Уэлша использовался для сравнения между крысами fa / fa (красный, n = 5) и + / + (синий, n = 5) ((a), (b) и (c)) и между fa / fa крыс в обоих штаммах (n = 5-6) (d).

Секреция инсулина из островков поджелудочной железы штаммов ZFDM и ZF. Секреторные ответы инсулина на одну только глюкозу (11,1 мМ) и глюкозу плюс GLP-1 (10 нМ) у крыс (a) fa / + (n = 6) и (b) fa / fa (n = 6) в штамме ZFDM при 7 недель. Секреторные ответы инсулина у крыс (c) fa / + (n = 6) и (d) fa / fa (n = 6) в штамме ZFDM в возрасте 11 недель. Секреторные ответы инсулина у крыс (e) + / + (n = 6) и (f) fa / fa (n = 6) в штамме ZF в возрасте 11 недель. Данные выражаются как среднее ± SEM. Различия в секреции инсулина с островков поджелудочной железы оценивали с использованием метода Туки-Крамера.

Гистологическая характеристика поджелудочной железы штаммов ZFDM и ZF. Репрезентативная гистология поджелудочной железы fa / + ((a), (b), (g), (h), (m) и (n)) и fa / fa ((c), (d), (i), (j), (o) и (p)) самцов крыс в штамме ZFDM и fa / fa ((e), (f), (k), (l), (q) и (r)) самец крыс в штамме ZF. Гематоксилин и окрашивание эозином.