Оксидативный стресс и сахарный диабет 2 типа

В последнее время сахарный диабет (СД) прочно занял лидирующую позицию среди заболеваний, обусловливающих инвалидизацию и смертность населения. По данным ВОЗ [1], на январь 2010 г. насчитывались 285 млн пациентов с СД, а по прогнозам, к 2030 г. это число достигнет 438 млн. При этом более 90% составят лица с cахарным диабетом 2-го типа (СД2). В России в 2010 г. зарегистрированы 2 822 634 пациента с СД2. Катастрофическое увеличение числа заболевших требует все более детального изучения патогенеза осложнений СД2 и разработки новых подходов к их профилактике и лечению.

Формирование окислительного стресса при сахарном диабете

При СД возникают «идеальные» условия для формирования окислительного стресса: увеличивается содержание субстратов окисления (глюкоза и липиды) и уменьшается образование и снижается активность естественных антиоксидантных систем — таких, как глутатион, супероксиддисмутаза, каталаза и глутатионовая пероксидаза [2].

В настоящее время многие авторы [3] рассматривают окислительный стресс как «универсальную основу» развития всех осложнений при СД, обусловленных, в частности, нарушением эндотелиальной функции. Более того, окислительный стресс, индуцированный гипергликемией, запускает механизмы повреждения β-клеток и тем самым ускоряет прогрессирование СД [4, 5].

При окислительном стрессе образуются свободные радикалы — молекулы, имеющие на внешней орбите неспаренный электрон, что придает им повышенную реакционную способность. Свободные радикалы стремятся получить второй электрон от других молекул, приводя к нарушению их структуры и функции [6]. Свободные радикалы представляют собой гетерогенную группу, но наибольшее их количество относится к соединениям реактивного кислорода. Окисление глюкозы приводит к образованию частиц активного кислорода (ROS): супероксида (•O2–), гидропероксила (•HRO2–), радикала гидроксила (•OH), радикала пероксила (•RO2). Также образуются частицы активного азота: окись азота (•NO), диоксид нитроген (•NO2–), пероксинитрит (ONOO–).

На фоне гипергликемии активируются многие метаболические пути, ответственные за увеличение образования ROS и тем самым за формирование окислительного стресса (рис. 1):Рисунок 1. Влияние гипергликемии на продукцию супероксида в эндотелиальных клетках.

1. Активация полиолового пути окисления глюкозы, при котором глюкоза превращается в сорбитол, приводит к истощению NADPH. Этот коэнзим участвует в образовании глутатиона — важного антиоксиданта. Уменьшение уровня NADPH приводит к снижению активности глутатиона и увеличению окислительного стресса [7].

2. Усиленное превращение сорбитола во фруктозу под действием сорбитол-дегидрогеназы приводит к увеличению уровня диацилглицерола, который в свою очередь активирует протеинкиназу С (PKC) [8]. Под действием PKC происходит индукция фермента, образующего супероксид NADFH-оксидазы в эндотелиальных и гладкомышечных клетках.

3. В результате неферментного гликирования образуются конечные продукты AGEs, что само по себе или через рецептор AGEs (RAGEs) ведет к продукции ROS [9, 10]. Конечные продукты гликирования также являются важными активаторами фермента NADFH-оксидазы.

4. Активация NADFH-оксидазы в эндотелиальных и гладкомышечных клетках является одним из самых важных источников ROS. Этот фермент активируется под воздействием РКС, конечных продуктов гликирования, инсулина и антиотензина II [11].

5. Дыхательная цепь митохондрии также является важным местом гиперпродукции ROC. В нормальных условиях практически весь кислород используется в митохондриях для синтеза АТФ и только 1—2% идет на синтез активных форм кислорода. В условиях СД это соотношение смещается в сторону синтеза супероксида [12, 13].

Другой важной составляющей развития окислительного стресса является снижение антиоксидантной защиты. Все ткани способны образовывать активные формы кислорода и каждая ткань содержит определенное количество ферментов-антиоксидантов. Ключевыми ферментами катаболизма ROS являются супероксиддисмутаза (SOD), каталаза, глутатион (GSH) и глутатион-пероксидаза (GP×). SOD-1 и SOD-2 метаболизируют супероксидрадикал до перекиси водорода (H2O2). Каталаза действует в пероксисомах и метаболизирует H2O2 до кислорода и воды. Глутатион-пероксидаза, состоящая из 6 изоэнзимов, содержится в цитоплазме и митохондриях и метаболизирует перекисноокисленные липиды и перекись водорода до воды и кислорода. Гипергликемия вызывает гликозилирование и инактивацию антиоксидантов, а сниженная активность SOD и уменьшение доступности глютатиона являются индикаторами наличия хронического окислительного стресса [14]. В экспериментах in vitro при поддержании постоянной активности SOD и каталазы увеличения окислительного стресса и поражения эндотелиальной функции не происходило, даже в условиях гипергликемии.

Роль окислительного стресса в развитии эндотелиальной дисфункции и атеросклероза

Одной из патогенетических основ макрососудистых осложнений при СД является атеросклероз. Пусковым фактором развития атеросклероза в настоящее время считается эндотелиальная дисфункция, сопутствующая СД [15].

Среди множества веществ, вырабатываемых эндотелием, особенно важным является оксид азота (NO). NO не только поддерживает сосудистый тонус, являясь одним из самых мощных вазодилататоров, но и выполняет ряд других важных функций, участвуя в регуляции физиологических процессов в сердечно-сосудистой системе и препятствуя атерогенезу. Антиатерогенные свойства оксида азота реализуются за счет ингибирования миграции и пролиферации гладкомышечных клеток, т.е. образования неоинтимы и гипертрофии сосудов [16]. NO блокирует также экспрессию адгезивных молекул эндотелия — ICAM-1, VCAM-1, E-селектина и хемотаксических пептидов моноцитов; уменьшает агрегацию, прилипание и инфильтрацию сосудистой стенки нейтрофилами и моноцитами. Более того, NO тормозит агрегацию и адгезию тромбоцитов. Таким образом, оксид азота препятствует развитию воспаления и атеросклеротического процесса в сосудистой стенке [17, 18].

Усиленное образование ROS при СД приводит к развитию эндотелиальной дисфункции и атеросклероза (рис. 2).Рисунок 2. Роль активных форм кислорода в формировании атеросклероза. Первое, на что нужно обратить внимание, это то, что повышение уровня ROS (особенно супероксид-аниона) вызывает нарушение синтеза и активности NO. Супероксид-анион соединяется с NO, образуя сильный оксидант — пероксинитрит (ONOO–); в результате NO теряет свою биологическую активность и антипролиферативные свойства. Пероксинитрит повреждает клетки путем нитрирования белков. Нитрирование подавляет работу калиевых каналов, ответственных за вазорелаксацию. Пероксинитрит способен также повреждать ДНК, что является обязательным стимулом для активации ядерного фермента PARP [19]. Эта полимераза истощает внутриклеточную концентрацию NAD+, замедляя гликолиз, транспорт электронов и образование АТФ, блокирует активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), что приводит к эндотелиальной дисфункции и развитию диабетических осложнений.

Еще один механизм снижения синтеза NO — разобщение eNOS на фоне окислительного стресса. В физиологических условиях eNOS существует в виде димера и продуцирует NO. Для синтеза NO необходимо действие кофактора — тетрагидробиоптерина (BH4). При недостатке этого вещества действие фермента смещается в сторону синтеза супероксида. Пероксинитрит (ONOO–) окисляет BH4, что приводит к разобщению еNOS и продуцированию супероксид-аниона вместо NO [20—22].

Второй аспект действия ROS — индукция экспрессии ICAM-1, VCAM-1, что приводит к адгезии моноцитов, лимфоцитов на эндотелиальной стенке и к облегчению проникновения нагруженных липидами моноцитов, липидов и тромбоцитов в субэндотелиальное пространство [23]. Более того, избыточное образование супероксидных и гидроксильных радикалов инициирует окисление ЛПНП. Перекисно-модифицированные ЛПНП в силу своей токсичности повреждают эндотелиальный покров артерий и также накапливаются в субэндотелиальном пространстве [24]. Здесь они приобретают способность секретировать биологически активные соединения (факторы роста, хемотоксины, митогены). Эти соединения стимулируют миграцию из медии в интиму гладкомышечных клеток и фибробластов, их пролиферацию и синтез соединительной ткани. ROS регулируют также экспрессию различных факторов роста и ростовых протоонкогенов (c-Myc, c-Fos и c-Jun [25]. Это приводит к пролиферации и миграции в интиму артерий гладкомышечных клеток и усилению продукции ими коллагена и эластина [26, 27]. Все вышеперечисленные механизмы в конечном итоге и приводят к атеросклерозу и тромбозу.

Роль активных форм кислорода в прогрессировании β-клеточной дисфункции

Как отмечалось выше, гипергликемия при СД является главным инициатором развития окислительного стресса во многих тканях; β-клетки не являются исключением и, более того, могут особенно сильно испытывать окислительный стресс, поскольку содержат крайне низкий уровень антиоксидантов [28, 29]. В островках поджелудочной железы обнаружено снижение экспрессии генов антиоксидантов и практически полное отсутствие активности глутатион-пероксидазы [30]. В исследованиях H. Takahashi и соавт. было показано, что D-глицеральдегид (D-GLIC) двояко влияет на образование и секрецию инсулина в зависимости от концентрации внутри клетки [31]. В низких концентрациях (<2 мМ) D-GLIC улучшает ответ инсулина на глюкозу, но в больших концентрациях ингибирует индуцированную глюкозой секрецию инсулина. Введение антиоксиданта NAC (N-ацетил-L-цистеин) блокировало неблагоприятный эффект больших доз D-GLIC на секрецию инсулина. J. Pi и соавт. [32] пришли к неожиданному выводу, что H2O2 облегчает глюкозозависимую секрецию инсулина, и предположили, что высокий уровень антиоксидантной активности в данной ситуации мог бы снижать секрецию инсулина. Таким образом, в условиях гипергликемии и окислительного стресса при СД поджелудочная железа оказывается менее защищенной по сравнению с окружающими тканями. Под действием сверхфизиологических уровней ROS происходит снижение экспрессии мРНК инсулина, уменьшение секреции инсулина и уменьшение индуцированной глюкозой секреции инсулина [33]. Эти изменения связаны с ослаблением связывания ДНК инсулина с фактором транскрипции PDX-1 (главным транскрипционным фактором образования и дифференцировки β-клеток) и MafA (мощным активатором транскрипции гена инсулина) [34, 35]. В экспериментах применение антиоксидантов восстанавливало экспрессию факторов транскрипции и их связывание с ДНК. Исходя из этого, можно сделать вывод, что хроническая гипергликемия вызывает снижение синтеза и секреции инсулина в результате повреждающего действия ROS на главные факторы транскрипции в поджелудочной железе PDX-1 и MafA. Y. Tanaka и соавт. [36] исследовали действие антиоксидантов (NAC и аминогуанидина) у крыс с сахарным диабетом. На культуре клеток HIT—T15 было выявлено увеличение промотерной активности гена инсулина, улучшение связывания ДНК с PDX-1 и MafA и увеличение уровня мРНК инсулина под воздействием антиоксидантов. Далее действие этих антиоксиданотов было исследовано на крысах с СД (ZDF). Эти препараты предотвращали окислительный стресс, вызванный гипергликемией, и увеличивали экспрессию гена инсулина. Схожие результаты получили H. Kaneto и соавт. [37, 38]: масса β-клеток мышей, леченных антиоксидантами, была значимо больше, чем у нелеченных мышей. Таким образом, лечение антиоксидантами подавляет апоптоз β-клеток и препятствует снижению их массы, вызванное окислительным стрессом, не меняя пролиферацию клеток.

Приведенные данные позволяют заключить, что окислительный стресс, обусловленный хронической гипергликемией, приводит к снижению функциональной массы β-клеток. Эти клетки очень уязвимы, так как их антиоксидантные возможности крайне низки. Снижение экспрессии и связывания MafA и PDX-1(необходимых регуляторов экспрессии гена инсулина) может быть основным механизмом глюкозотоксичности. Антиоксиданты предупреждают прогрессирование поражений β-клеток при диабете на животных моделях и выделенных островках поджелудочной железы.

Лечение

Исходя из изложенного, очевидно, что патогенетической терапией осложнений при сахарном диабете является терапия антиоксидантами; более того, использование антиоксидантов в эксперименте уменьшает апоптоз и сохраняет массу β-клеток. Хотя в эксперименте большие дозы витаминов-антиоксидантов (витамины С, Е) и мощные антиоксиданты (NAC и аминогуанидин) предотвращают окислительный стресс, в клинике такого эффекта добиться не удается. Разработка принципиально новых антиоксидантов (миметики супероксиддисмутазы, каталазы, блокаторы РКС), возможно, откроет новую эру в лечении и профилактике СД.

Вспомогательная терапия антиоксидантами может увеличить эффективность традиционного лечения сахарснижающими препаратами. Учитывая тот факт, что все современные гипогликемические препараты обладают практически одинаковой эффективностью в плане снижения HbA1C (примерно на 1—1,5%), необходимо назначение средств, дополнительно влияющих на окислительный стресс, улучшающих эндотелиальную функцию и замедляющих развитие кардиоваскулярных осложнений.

Одним из таких препаратов является Гликлазид МВ (препарат сульфонилмочевины второго поколения), имеющий уникальную структуру. Помимо своего высокого гипогликемического потенциала, данный препарат обладает рядом интересных свойств. Исследуя его влияние на окислительный стресс, K. Kimoto и соавт. [39] обнаружили, что в условиях окислительного стресса, вызванного Н2O2, он лучше предохраняет β-клетки от гибели, чем глибенкламид (55,9% выживших клеток в группе гликлазида и 30% в группе глибенкламида, p<0,01). В исследованиях in vitro гликлазид выполнял роль ловушки свободных радикалов [40]. В 6-месячном исследовании P. Jennings и соавт. [41] у пациентов, получающих терапию гликлазидом, обнаружена более низкая концентрация перекисномодифицированных липидов, более высокий уровень SOD и более выраженное снижение агрегации тромбоцитов, чем у больных СД, получавших глибенкламид. При этом уровень гликированного гемоглобина был одинаковым в обеих группах, что подтверждает независимость эффектов препаратов от их гипогликемического действия. R. Brein [42] исследовал in vitro эффект 1 мкM гликлазида, глибенкламида, глимепирида, глипизида и толбутамина на общую антиоксидантную активность плазмы (ОАКП) и окисляемость ЛПНП и in vivo оценивал антиоксидантный эффект гликлазида в 10-месячном наблюдении за 44 больными СД2. Результаты, полученные in vitro, показали возрастание устойчивости ЛПНП к окислению на фоне действия гликлазида; другие препараты из группы сульфонилмочевины не повлияли на этот показатель. Схожие результаты были получены и в отношении ОАКП: только гликлазид увеличил антиоксидантный потенциал плазмы (с 1,09±0,11 до 1,23±0,11 ммоль/л; р<0,01). В исследовании in vivo на фоне терапии гликлазидом определялись уровни изопростана, ОАКП, SOD и тиоловых соединений. Лечение гликлазидом улучшило все эти показатели. Таким образом, гликлазид обладает свойствами антиоксиданта. Авторы предположили, что данное свойство связано со специфическими особенностями молекулярной формулы гликлазида. В исследовании A. Desfait [43] участвовали пациенты, СД2 с неудовлетворительным контролем гликемии на фоне приема глибурида. Через 3 мес после перевода этих больных на терапию гликлазидом МВ у них снижался уровень пероксидов липидов, уменьшалась адгезия моноцитов и падала продукция ФНО-α, что имеет важное значение в плане профилактики атеросклероза.

Увеличение толщины интима—медия артерий является предиктором развития инфаркта миокарда и инсульта [44]. В 3-летнем исследовании N. Katakami и соавт. [45] было показано, что у больных СД2 гликлазид и метформин в большей степени (р<0,05) ограничивают увеличение толщины интима—медия сонной артерии независимо от их влияния на гликированный гемоглобин и артериальное давление, чем глибенкламид. Авторы сделали вывод, что прием гликлазида и метформина уменьшает прогрессирование атеросклеротического процесса в сонных артериях и предположили, что антиатерогенный эффект метформина связан с его влиянием на фибринолитическую активность и образование ROS, тогда как антиатерогенный эффект гликлазида МВ является следствием его способности нейтрализовать свободные радикалы, восстанавливать функцию эндотелия и уменьшать реактивность тромбоцитов.