Рецепторы инсулина при сахарном диабете

Состояние клеточных мембран

Общими чертами биологических мембран, важными для их функционирования, являются текучесть, способность к конформационным перестройкам и фазовым переходам. Развитие сахарного диабета 1 и 2 типа сопровождается увеличением жесткости клеточных мембран. Причиной этого являются не только интенсификация процессов перекисного окисления липидов, но и погружение части поверхностных белков в липидный слой с изменением топографии мембранного гликокаликса При снижении дозы инсулина больным, имеющим низкий показатель экспонирования белков на фоне гиперлактацидемии, состояние мембран улучшалось: показатель экспонирования белков увеличивался и отмечалась тенденция к снижению повышенного параметра упорядоченности мембран [Вахрушева Л.Л. и др., 2004].

Эритроциты больных сахарным диабетом помимо изменения морфологии теряют способность к проникновению в поры фильтров, изменяется скорость и характер растекания плазмы и сыворотки в порах фильтров [Воинов Д.А. и др., 2003]. При оценке электронного парамагнитного резонанса с использованием в качестве зонда короткоцепочечного остатка жирной кислоты СдР9 с иминоксильным фрагментом обнаружилось, что образцы крови больных сахарным диабетом теряют способность взаимодействия с зондом (зонд не встраивается в липидный слой мембраны) [Воинов Д.А. и др., 2003].

Подобные изменения цитоплазматических мембран клеток гепатоцитов, почечной ткани, скелетных мышц, легочной ткани наблюдались при экспериментальном сахарном диабете [Микаэлян Н.П. и др., 1999].

Параметры инсулинорезистентности зависят от степени пероксидации фосфолипидов в липидном бислое мембран. Экспериментальный сахарный диабет характеризуется повышением гидролитической и трансферазной активность эндогенных липолитических ферментов. Активность фосфолипазы Д повышается при образовании холина и зависит от тяжести течения сахарного диабета [Расулова В.Б., Рахимова Н.М., 2004].

Строение и кинетика инсулинового рецептора

Своё действие на уровне клетки инсулин осуществляет через соответствующий рецептор. Анализу сведений о локализации, химической природе, обмене и функциональной активности рецепторов инсулина в норме и патологии посвящён ряд фундаментальных работ [Комиссаренко В.П. и соавт.,1984, Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., 1987, Микаелян Н.П., 1988, 1990]. Инсулиновый рецептор подробно исследован с помощью биохимических методов и технологии рекомбинантных ДНК. Рецептор инсулина (РИ) представляет собой тирозиновую протеинкиназу, т.е. протеинкиназу, фосфорилирующую белки по ОН-группе остатков тирозина. Это гликопротеин, построенный из двух a – субъединиц (130 кДа) и двух b -субъединиц (95 кДа); первые расположены целиком вне клетки, на ее поверхности, вторые пронизывают плазматическую мембрану.

Рецептор инсулина постоянно синтезируется и распадается; его период полужизни составляет 7–12 ч. Рецептор синтезируется в виде одноцепочечного пептида в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме и быстро гликозируется в аппарате Гольджи. Предшественник человеческого рецептора инсулина состоит из 1382 аминокислот, его мол.масса составляет 190000, при расщеплении он образует зрелые a – и -b субъединицы. У человека ген инсулинового рецептора локализован в хромосоме 19. Инсулиновый рецептор имеет высоко консервативную структуру, еще более консервативную, чем структура самого инсулина.

Строение инсулинового рецептора, способность различных инсулинов связываться с рецепторами и вызывать биологические реакции, практически идентичны в клетках всех типов и всех видов.

Рецептор к инсулину с высокой специфичностью распознает в молекуле места связывания инсулина и осуществляет комплексирование с ним; опосредует передачу соответствующего сигнала, направленного на активацию внутриклеточных обменных процессов; осуществляет эндоцитоз гормонального комплекса, что приводит к лизосомальному протеолизу инсулина с одновременным возвращением субъединицы к мембране клетки.

Комиссаренко В.П. и соавт., (1984) выделяет три основные функции рецептора инсулина:

1. Питание клеток (увеличение потока питательных веществ внутрь клеток и их утилизацию во всех направлениях, приводящих к преобладанию анаболических процессов над катаболическими);
2. Обеспечение транспорта инсулина с эритроцитами крови к тканям;
3. Обеспечение перехода инсулина из крови через гистогематические барьеры в межклеточную жидкость.

Взаимодействие гормона с рецепторами характеризуется быстротой, обратимостью, зависимостью от температуры, величины рН, присутствия одновалентных и двухвалентных катионов и гуаниновых нуклеотидов, кооперативностью и наличием специфических и неспецифических участков связывания. При взаимодействии инсулина с рецепторами имеет место отрицательная и положительная кооперативность связывания. Отрицательная кооперативность, сопровождающаяся снижением сродства рецепторов к гормону в 10 раз, обусловлена увеличением скорости диссоциации комплекса гормон-рецептор, снижением размеров солюбилизированного рецептора.

Таблица 1.

Численность рецепторов к инсулину в различных клетках. (Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., 1987 )

Экспериментально показаны возрастные различия в регуляции эффектов инсулина. Рецепторы к инсулину у новорожденных крыс имеют большее сродство к гормону, они обнаруживаются в больших количествах, обладают низкой способностью к десенситизации. Скорость деградации инсулина у новорожденных крыс в 3 раза ниже, чем у взрослых. Это связано с тем, что гиперинсулинемия более губительно влияет на молодых (летальность 46,7 %), чем на старых особей (летальность 10 %) [Poljak-Blazi M. et al. ,1992, Сергеев П.В., Шимановский Н.Л.,1987].

Рецепторы инсулина обнаруживаются в клетках почти всех типов, но в разном количестве (Таблица 1). Во всех изученных тканях рецепторы инсулина обладают одинаковой специфичностью связывания.

Как мы видим из данных, представленных в таблице, огромное число инсулиновых рецепторов имеют клетки печеночной и жировой тканей. Больше всего их в гепатоцитах (до 250.000 рецепторов на одну клетку) и в адипоцитах (до 50.000); в моноцитах и эритроцитах на порядок меньше. Концентрация инсулина в крови 10-10 – 10-9 М, т.е. ниже, чем усредненное сродство связывания инсулина с рецептором, 0,01-0,0001 ЕД. (Во множество раз больше инсулина поступает при инсулинотерапии!) Поэтому количество занятых рецепторов зависит не только от концентрации инсулина, но и от количества рецепторов на клетке. Экзогенный инсулин связывает резерв инсулиновых рецепторов.

По видимому рецепция зависит, во-первых, от энергетических потребностей клеток тканей; во-вторых, от способностей и необходимости запасания энергии. В этой связи необходимо осмыслить следующие вопросы: являются ли гепатоциты и адипоциты участниками регуляции уровня инсулина в крови, оказывают ли избыточные концентрации инсулина повреждающее действие на эти клетки, возможно ли развитие их тканевой инсулинорезистентности, по каким причинам нарушается их функция при сахарном диабете?

Структура

Первоначально транскрипты альтернативных вариантов сплайсинга гена INSR транслируются с образованием одного из двух мономерных изомеров: IR-A, в котором вырезан экзон 11, и IR-B, в котором есть экзон 11. Включение экзона 11 приводит к добавлению 12 аминокислот выше фурина в сайте протеолитического расщепления.

При димеризации рецептора, после протеолитического расщепления α- и β-цепей, дополнительные 12 аминокислот остаются на С-конце α-цепи (обозначенной αCT), где они предположительно влияют на взаимодействия рецептора и лиганда[5].

Каждый изомерический мономер структурно разбит на 8 различных доменов; домен лейцин-обогащённых повторов (L1, остатки 1-157), регион, богатый цистеином (CR, остатки 158—310), дополнительный домен лейцин-обогащённых повторов (L2, остатки 311—470), три типа доменов фибронектина III; FnIII-1 (остатки 471—595), FnIII-2 (остатки 596—808) и FnIII-3 (остатки 809—906).

Кроме того, вставной домен (ID, остатки 638—756), находящийся в пределах FnIII-2, содержащий сайт расщепления α/β фурина, протеолиз которого действуют как в IDα- так и IDβ-доменах. В β-цепи ниже области FnIII-3 находится трансмембранная спираль и внутриклеточная околомембранная область, непосредственно выше внутриклеточного каталитического тирозинкиназного домена, ответственного за активацию внутриклеточных сигнальных путей[6].

При расщеплении мономера на соответствующие α- и β-цепи рецептор гомо- или гетеродимеризуется через ковалентно дисульфидную связь, а между мономерами в димере образуется две дисульфидные связи, идущие от каждого α-цепи.

Общая структура 3D эктодомена[en], обладает четырьмя сайтами связывания лиганда, напоминает перевернутую V. Каждый мономер поворачивается примерно 2 раза вокруг оси, проходящей параллельно перевернутой V, L2 и FnIII-1 доменам от каждого мономера, формирующего вершину перевернутой V[6][7].

Связывание лиганда

Эндогенные лиганды инсулинового рецептора включают инсулин, IGF-I и IGF-II. Связывание лиганда с α-цепями эктодомена IR вызывает структурные изменения в рецепторе, ведущие к автофосфорилированию различных остатков тирозина во внутриклеточном домене TK в β-цепи.

Эти изменения способствовуют рекрутированию определенных адаптерных белков[en], таких как белки субстрата инсулинового рецептора (IRS) в дополнение к SH2-B[en] (гомолог Src 2 — B), APS и протеинфосфатазы, таких как PTP1B[en], в конечном итоге, способствующих последующим процессам, связанным с гомеостазом глюкозы в крови[8].

Строго говоря, отношения между инсулиновым рецептором и лигандом показывают сложные аллостерические свойства. Кроме того, наблюдение, что скорость диссоциации IR-лиганда увеличивается при добавлении несвязанного лиганда предполагает, что природа этого сотрудничества отрицательна; иначе говоря, начальное связывание лиганда с IR ингибирует дополнительное связывание со своим вторым активным сайтом, демонстрируя аллостерическое ингибирование[9].

Хотя точный механизм связывания IR с его лигандом структурно ещё не выяснен, с точки зрения системной биологии, биологически значимое предсказание кинетики[en] IR-лиганд (инсулин/IGF-I) было определено в контексте доступной в настоящий момент структуры эктодомена IR[6][7].

Эти модели утверждают, что каждый мономер IR имеет 2 инсулиновых сайта связывания; Сайт 1, который связывается с «классической» поверхностью связывания инсулина: состоящей из L1 плюс αCT доменов и сайта 2, состоящий из петель на стыке FnIII-1 и FnIII-2, по прогнозам, связывающихся с «новым» гексамерным лицом сайта связывания инсулина[1].

Так как каждый мономер предоставляет IR эктодомену представление 3D «зеркальной» взаимодополняемости, N-терминальный сайт 1 из одного мономера, в конечном счете сталкивается с C-терминальным сайтом 2 второго мономера, что также верно для каждого зеркального дополнения мономеров (противоположная сторона структуры эктодомена).

Текущая литература отличает сайты связывания дополнений, назначив на сайте 1 и 2 мономерные сайты дополнений, как 3 и 4 или как сайт 1′ и 2′ соответственно[1][10].
.

Таким образом, эти модели утверждают, что каждый IR может связываться с молекулой инсулина (который имеет две связывающих поверхности) в 4 местах, посредством сайтов 1, 2, (3/1′) или (4/2′). Поскольку каждый сайт 1 проксимально сталкивается с сайтом 2, по прогнозам, произойдет связывания инсулина конкретным сайтом, «сшивание»[en] с помощью лиганда между мономерами, (то есть [мономер 1 Сайт 1 — Инсулин — мономер 2 сайт (4/2′)] или [мономер 1 сайт 2 — Инсулин — мономер 2-сайт (3/1′)]).

В соответствии с действующим математическим моделированием IR-инсулиновой кинетики, есть два важных последствия для событий сшивания инсулина; 1. в вышеупомянутом наблюдении отрицательное взаимодействие IR и его лиганда, после связывания лиганда с IR снижается и 2.

физическое воздействие приводит к сшиванию эктодомена в такой конформации, которая необходима для наступления событий внутриклеточного фосфорилирования тирозина (то есть эти события служат требованием к активации рецептора с последующим поддержанием гомеостаза глюкозы в крови)[8].

Биологическое значение

Рецепторы тирозинкиназы[en], в том числе инсулиновый рецептор, опосредуют свою активность, вызывая добавление фосфатной группы к конкретным тирозинам в клетках определенных белков. В «подложке» белки, которые фосфорилируются инсулиновым рецептором включает белок, называемый «IRS-1» для «инсулинового рецептора подложки 1».

Связывания и фосфорилирования IRS-1 в конечном итоге приводит к увеличению высокого сродства молекул транспортёра глюкозы (GLUT4) на внешней мембране инсулиночувствительных тканей, в том числе мышечных клеток и жировой ткани, и, следовательно, к увеличению поглощения глюкозы из крови в этих тканях.

Другими словами, глюкозный транспортёр GLUT4 транспортируется из клеточных везикул к клеточной поверхности, где он затем может опосредовать транспорт глюкозы в клетку.
.

Патология

Основная деятельность активации инсулинового рецептора — индуцировать поглощение глюкозы. По этой причине «нечувствительность инсулина», или снижение сигнализации инсулинового рецептора, приводит к сахарному диабету 2 типа — клетки неспособны принять глюкозу и в результате — гипергликемия (повышение циркуляции глюкозы) и все последствия диабета.

Пациенты с инсулинорезистентностью могут иметь признаки чёрного акантоза.

Несколько пациентов с гомозиготной мутацией гена INSR были описаны, как получившие синдром Донохью[en]. Это аутосомно-рецессивные нарушения делают совершенно нефункциональными инсулиновые рецепторы.

Эти пациенты имеют низкорасположенные, часто выпуклые, уши, ноздри, утолщенные губы и сильную задержку роста. В большинстве случаев, прогноз для этих пациентов является крайне бедным, смертельный исход случается в течение первого года жизни.

Другие мутации того же гена вызывают менее тяжелый синдром Робсона-Менденхолла[en], при которых пациенты имеют характерно аномальные зубы, гипертрофированные дёсны и расширение шишковидной железы. Оба заболевания представляют флуктацию уровня глюкозы: после приема пищи глюкоза изначально очень высока, а затем резко падает до аномально низких уровней[11].

Регуляция экспрессии генов

Активированные IRS-1 действуют в качестве вторичного мессенджера в клетке, чтобы стимулировать транскрипцию инсулинорегулируемых генов. Во-первых, белок Grb2 связывает Р-Tyr остаток IRS-1 в его домене SH2[en].

Grb2 становится в состоянии связать SOS, который в свою очередь катализирует замену связанного GDP с GTP в Ras, G-белка. Этот белок затем начинает каскад фосфорилирования, что приводит к активации митогеноактивируемой протеинкиназы (МАРК), которая входит в ядро и фосфорилирует различные факторы ядерной транскрипции (например, Elk1).

Стимуляция синтеза гликогена

Синтез гликогена также стимулируется инсулиновым рецептором с помощью IRS-1. В этом случае это SH2-домен[en] из киназы PI-3 (PI-3K[en]), который связывает P-Tyr из IRS-1.

Теперь активации PI-3K может конвертировать мембранные липидные фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфата[en] (PIP2) до фосфатидилинозит 3,4,5-трифосфата[en] (PIP3). Это косвенно активирует протеинкиназу PKB (Akt) с помощью фосфорилирования.

РКВ затем фосфорилирует несколько целевых белков, в том числе киназу гликогенсинтазы 3[en] (GSK-3). GSK-3 несёт ответственность за фосфорилирование (и, следовательно, деактивацию) гликогенсинтазы.

Когда GSK-3 фосфорилируется, он отключается, и предотвращается деактивации гликогенсинтазы. Этим окольным путём инсулин увеличивает синтез гликогена.

Деградация инсулина

После того как молекула инсулина стыкуется с рецептором и активирует его, она может быть выпущена обратно во внеклеточную среду, или может быть деградирована в клетке. Деградация обычно включает эндоцитоз инсулино-рецепторного комплекса с последующим действием фермента, разрушающего инсулин.

Большинство молекул инсулина деградируют в клетках печени. Было подсчитано, что типичная молекула инсулина деградирует приблизительно через 71 минуту после первоначального выпуска в кровоток[12].

Взаимодействия

Инсулиновый рецептор, как было выявлено, взаимодействует с ENPP1[13], PTPN11[14][15], GRB10[16][17][18][19][20], GRB7[21], PRKCD[22][23], IRS1[24][25], SH2B1[26][27] и MAD2L1[28].