Способ моделирования сахарного диабета у крыс

Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ САХАРНОГО ДИАБЕТА (CД)

МОДЕЛИ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

1. ПАНКРЕАТЭКТОМИЧЕСКИЕ

На собаках

Авторы: Й. Меринг и О. Минковский, и независимо от них и почти одновременно, Де Доминичи (1889 г.). У животных после панкреатэктомии развивалась типичная картина ИЗСД с истощением, кетоацидозом и гибелью. О. Минковский показал, что пересадка кусочка поджелудочной железы под кожу собаки предохраняет панкреатэктомированное животное от СД.

В 1908 г. Й. Форшбах продемонстрировал на данной модели, что СД после панкреатэктомии может быть купирован при парабиотической связи кровеносной системы подопытной и интактной собак. Так в генезе СД была установлена роль нехватки неидентифицированного гормона поджелудочной железы.

Л. В. Cоболев (1901) усовершенствовал экспериментальную модель СД на собаках, предложив вызывать аутолиз экзокринной части поджелудочной железы путем перевязки ее выводного протока: в этом случае островки Лангерганса сохранялись. Разрушение экзокринных панкреацитов не приводило к развитию СД, в отличие от тотальной панкреатэктомии и удаления островков у собак с атрофированной экзокринной частью поджелудочной жедезы. Л. В. Соболев постулировал, что вещество, нехватка которого повинна в возникновении СД, вырабатывается островками Лангерганса и рекомендовал получать его путем перевязки выводного протока железы новорожденных телят, у которых экзокринная часть железы слабо развита.

Этот метод и применили Ф. Г. Бантинг, К. Х. Бест и Дж. Р. Маклеод для выделения из островков Лангерганса инсулина (1921–1922). Данное открытие было отмечено Нобелевской премией по медицине в 1923 г.

На крысах

Воспроизведение панкреатэктомической модели СД у крысы долгое время не удавалось, поскольку диффузное распределение поджелудочной железы крыс по брыжейке не позволяло удалить железу целиком. Р. О. Скау в 1957 г. методически разрешил эту

ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ

проблему (тотально удалил поджелудочную железу) и получил у крысы типичный СД. Данная модификация модели Мерин- га–Минковского развеяла миф о том, что крысы резистентны к воспроизведению сахарного диабета при помощи панкреатэктомии.

На южноамериканских жабах

В 40-х годах ХХ столетия аргентинский эндокринолог Б. А. Усай моделировал СД, удаляя поджелудочную железу у южноамериканских жаб, и показал, что проявления экспериментального СД значительно ослабевают, вплоть до полного исчезновения, если удалить аденогипофиз и надпочечники. Предварительная гипофизэктомия делает жаб значительно более резистентными к диабетогенному эффекту резекции поджелудочной железы. Эти опыты позволили установить факт продукции контринсулярных гормонов в аденогипофизе и надпо- чечниках и также удостоились Нобелевской премии по медицине (1947 г.). Впоследствии выяснили, что субтотальная резекция поджелудочной железы ведет к латентному сахарному диабету, который переходит у подопытного животного из скрытого в явный при нагрузке контринсулярными гормонами (тиреоидные, соматотропин, глюкокортикоиды) или при перекармливании углеводами.

2. ХИМИЧЕСКИЕ МОДЕЛИ

Аллоксановый диабет

Дж. С. Данн и Н. Г. Мак Летчи обнаружили в 1943 г., что аллоксан (уреид мезоксалевой кислоты) избирательно повреждает островковые В-клетки, вызывая их некроз, и приводит к развитию СД у крыс, мышей, кроликов и собак. Аллоксановая модель позволила установить роль собственно В-клеток в продукции инсулина, а их повреждения — в патогенезе ИЗСД. Так как аллоксан может возникать в организме эндогенно — из мочевой кислоты через диалуровую, а также в связи с частым клиниче- ским сочетанием СД и гиперурикемии, Я. А. Лазарис модифицировал аллоксановую модель и предпринял успешную попытку вызвать СД у крыс токсическими дозами мочевой кислоты (600–680 мг/кг массы тела), на фоне дефицита пищевых серусодержащих аминокислот (1957).

Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ

Дитизоновый диабет

Х. Маске (1957) для моделирования ИЗСД применил дитизон (дифенилтиокарбазон) и оксином (8-оксихинолин). Это так называемые цинковые модели, поскольку действующие в них химические вещества образуют комплексы с цинком в секреторных гранулах В-клеток. Это нарушает накопление инсулина и его секрецию. Закономерно, диабет возникает лишь у кроликов, островковые В-клетки которых богаты цинком. Дитизон вводят кролику в ушную вену (100 мг на 1 кг массы животного). Через сутки после введения у кролика развивается сахарный диабет.

Стрептозотоциновый диабет

Еще одна «химическая» модель СД основана на применении стрептозотоцина — антибиотика, избирательно повреждающего В-клетки у крысы.

Большое значение имело установление того факта, что многие «химические» модели на деле являются химико-иммунологи- ческими. Так аллоксан, мочевая кислота и стрептозотоцин запускают против В-клеток аутоиммунный процесс.

Данные модели не воспроизводятся у тимэктомированных иммунодефицитных животных.

Развитие экспериментального СД, индуцированного хими- чески, может быть заторможено антилимфоцитарной сывороткой и иммунодепрессантами.

СД, полученный по этим моделям, подвергается адоптивному переносу при введении лимфоцитов от больных подопытных животных интактным.

В то же время некоторые химически индуцированные модели СД, например, «цинковые», иммунонезависимы.

3. ВИРУСНАЯ МОДЕЛЬ

Развитие представлений о вирусных диабетогенах неотделимо от становления вирусной модели ИЗСД. Заражение подопытных мышей М-вариантом вируса мышиного энцефаломиокардита в 40% случаев приводит к развитию аутоиммунного инсулита, оканчивающегося ИЗСД. Данная модель также блокируется тимэктомией и иммунодепрессией, т. е. носит иммунопатологиче- ский характер.

ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ

4. СПОНТАННЫЙ САХАРНЫЙ ДИАБЕТ У ЖИВОТНЫХ ЧИСТЫХ ЛИНИЙ

Еще Г. Негели (1896) сформулировал первую генетическую гипотезу о природе СД. С обнаружением в 1974 г. Дж. Нерупом и соавт. связи между СД и генами ГКГС исследования в области генетического моделирования СД особенно активизировались.

Животные чистых линий, развивающие спонтанный СД, служат объектами эффективного изучения как ИЗСД, так и ИНСД. Подобных генетических моделей СД известно в настоящее время множество. Это чистые линии китайских хомячков, мышей ККА, мышей OB/OB и DB/DB, мышей AB/AB, колючих мышей, новозеландских мышей, песчаных крыс, крыс BB (BioBreeding), мышей NOD (Non Obese Diabetic), крыс WBH/Kobe.

У мышей NOD имеется генетическая аномалия экспрессии антигенов ГКГС 1-го класса. Это приводит к облегченной провокации аутоаллергии против панкреатических В-клеток и развитию ИЗСД. Животные характеризуются избытком Т-эффекто- ров, действующих против островковых антигенов, а также дефицитом супрессорных функций лимфоцитов.

Крысы ВВ, напротив, характеризуются наследственной лимфопенией и дефицитом цитотоксических лимфоцитов. Тем не менее они развивают спонтанный аутоиммунный инсулит, который так же, как в случае мышей NOD, приостанавливается неонатальной тимэктомией или применением иммунодепрессантов, а в естественных условиях ведет к неизбежному ИЗСД.

Крысы WBH/Кобе самопроизвольно вырабатывают в высоких титрах аутоантитела к собственному инсулину, которые повреждают В-клетки и формируют основу для развития ИЗСД.

МОДЕЛИ ИНСУЛИННЕЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

У мышей линий ОВ и DB развивается спонтанно ожирение, инсулинорезистентность и ИНСД. Они представляют экспериментальные модели первичного ожирения, имеющие соответственно наследственный дефект гена лептина (ОВ) или лептинового рецептора (DB). У некоторых линий спонтанно диабетических мышей обнаружено сниженное содержание переносчика глюкозы Glut 2 в островковых -клетках. При этом аномально низкий уровень переносчика Glut 2 в островковых -клетках коррелирует с ослабленной секрецией инсулина в ответ на повышение содержания глюкозы в крови.

Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ

Некоторые экспериментальные животные-модели инсулинорезистентного СД, по-видимому, имеют дефект хотя бы одного из белков-переносчиков глюкозы в плазматической мембране мышечных клеток.

Цель занятия:

Изучить особенности обмена веществ у кролика с экспериментальным сахарным диабетом (модель дитизонового сахарного диабета):

1.Определить наличие кетоновых тел в моче (проба Легаля)

2.Определить наличие сахара в моче (проба Фелинга).

Для исследования предлагается моча кролика, у которого был воспроизведен сахарный диабет, и моча контрольного (интактного) кролика. После проведения качественных реакций определения кетонов и сахара, делается заключение о принадлежности мочи больному или здоровому кролику.

Опыт 1. Качественная реакция определения кетоновых тел в моче (проба Легаля)

Реакция с нитропруссидом натрия дает положительный результат с ацетоуксусной килотой и ацетоном, причем реактив наиболее чувствителен к ацетоуксусной кислоте.

В пробирку наливают 0,5 мл исследуемой мочи и подщелачи- вают ее 2–3 каплями 10% раствора едкого кали.

Добавляют 3 капли 10% свежеприготовленного водного раствора нитропруссида натрия. Возникает рубиново-красное окрашивание, обусловленное присутствием в любой моче креатинина.

Добавляют 3 капли ледяной уксусной кислоты.

При наличии в моче кетонов цвет ее рубиново-красный и фиолето- во-красный. Если кетонов в моче нет — цвет становится зеленова- то-желтым.

Опыт 2. Качественная реакция определения сахара в моче (реакция Фелинга)

К 3 мл исследуемой мочи добавляют 2 мл реактива Фелинга. Пробирку взбалтывают. Верхнюю часть пробирки нагревают до кипения.

Реакция основана на способности глюкозы восстанавливать гидрат окиси меди (синего цвета) в гидрат закиси меди (желтого цвета), а затем — в закись (красный цвет).

ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ

При наличии в моче сахара нагретая часть смеси изменяет свою окраску: синий цвет переходит в желтый или в кирпич- но-красный, а затем появляется красноватый осадок.

Реактив Фелинга: свежеприготовленная смесь реактива 1 (водный раствор сернокислой меди) и 2 (водный раствор едкого натра и сегнетовой соли).

В выводе отметить, какие метаболические нарушения зарегистрированы у подопытного кролика, каков их патогенез.

Животные, оборудование, реактивы

1. Моча интактного кролика. 2. Моча кролика с воспроизведенным дитизоновым диабетом. 3. Дитизон (дифенилтиокарбазон) — 0,5 г. 4. 10% раствор едкого кали. 5. 10% свежеприготовленный раствор нитропруссида натрия. 6. Ледяная уксусная кислота. 7. Водный раствор сернокислой меди. 8. Водный раствор едкого натра. 9. Водный раствор сегнетовой соли. 10. Пробирки стеклянные. 11. Штатив для пробирок. 12. Бюретки для реактива Фелинга и для мочи каждого из кроликов.

Литература

1.Американская диабетическая ассоциация. Диабет от А до Я / Под ред. А. С. Фокина, А. А. Фокина, Л. П. Чурилова, Ю. И. Строева. — СПб: ÝËÁÈ-ÑÏá, 2003. — 208 ñ.

2.Баранов В. Г. Экспериментальный сахарный диабет. Роль в клинической практике. Л.: Наука. — 240 с.

3.Бергер М., Старостина Е. Г., Йоргенс В., Дедов И. Практика инсулинотерапии. Берлин-Гейдельберг: Шпрингер Ферлаг, 1990. — 365 с.

4.Фелиг Ф., Бекстер Дж. Д., Бродус А. Е., Нромен Л. А. (ред.). Эндокринология и метаболизм. — М.: Медицина, 1985. — Т. 1–2.

5.Ãåíec B. C., Ãåíec C. Ã. Патофизиология инсулинонезависимого сахарного диабета II типа // Патол. физиол. эксперим. терап. — 1993. — ¹ 10. — C. 253–304

6.Зайчик А. Ш., Утехин В. И., Чурилов Л. П., Слободской Е. В. Патофизиология сахарного диабета // В кн.: Нарушения иммунитета и метаболические расстройства. Ч.1. — СПб: Èçä-âî ÏÏÌÈ, 1995. — Ñ. 86–187.

7.Êóíå Å.-Õ. è äð. Диабет. — М.: Знание, 2001. — 176 с.

8.Строев Ю. И., Либерман И. С. Общая характеристика ангиопатий при сахарном диабете // В кн.: Генетика сахарного диабета. — Л.: Медицина, 1988. — С. 21–35.

Òåìà 11. ПАТОФИЗИОЛОГИЯ ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО ОБМЕНА

Клетка является основной функциональной единицей человече- ского организма. Для выполнения специфических физиологиче- ских задач клеткам необходима устойчивая среда обитания, включая стабильное обеспечение питательными веществами и постоянное выведение продуктов метаболизма. Тщательное регулирование количества жидкости в организме способствует сохранению стабильности внутренней среды.

Водно-солевой обмен — совокупность процессов поступления воды и солей в организм, их абсорбция, распределение во внутренних средах и выделение. Различают свободную, èëè мобильную, âîäó, которая является средой, где растворены соли и белки; воду, удерживаемую коллоидами в виде так называемой воды набухания, ò. å. связанную воду, è конституционную (внутримолекулярную) воду, входящую в состав молекул белков, жиров и углеводов и освобождающуюся при их окислении. В ходе метаболи- ческих превращений вода может переходить из одного состояния в другое.

СОСТАВ ЖИДКОСТЕЙ ОРГАНИЗМА

Все жидкости организма распределяются между двумя главными жидкостными компартментами (пространствами, отсеками): внутриклеточным и внеклеточным.

Внутриклеточная жидкость. Имеются значительные разли- чия в количественном распределении воды и электролитов между внутри- и внеклеточной жидкостями. Во внутриклеточной жидкости более высокие концентрации ионов калия, магния, фосфатов и сульфата. Эти различия поддерживаются вопреки тенденции к выравниванию концентраций. Разность концентраций образует необходимые для возбудимости нервов и мышц

ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ

биоэлектрические потенциалы. Сохранение различных концентраций калия и натрия в клетках и внеклеточных пространствах способствует созданию электрического потенциала клетки, связанного с энергией обмена веществ. Большую роль в регуляции внутриклеточного объема жидкости и ее химического состава играет клеточная мембрана, которая высокопроницаема для воды, но ее проницаемость для большинства электролитов относительно низкая. Мембраносвязанная АТФ-аза обеспечивает движение противоположно направленных потоков Na+ è Ê+. Клеточная мембрана не проницаема для большинства белков, поэтому их концентрация в клетке высока. Белки представляют собой недиффундирующие анионы, т. к. мембраносвязанная Na+ è Ê+-зависимая АТФ-аза обеспечивает обмен Na+ è Ê+ в соотношении 3:2, что предотвращает развитие относительной внутриклеточной гиперосмолярности. У взрослых на внутриклеточную жидкость приходится примерно 2/3, что для мужчины со средней массой тела (70 кг) составляет приблизительно 27 л. У младенцев же, наоборот, только половина жидкости заключена в клетках.

Внеклеточная жидкость. Основная функция внеклеточной жидкости — обеспечение клеток питательными веществами и удаление продуктов обмена. Поддержание нормального объема внеклеточного пространства, особенно внутрисосудистой жидкости, очень важно для нормального функционирования организма. Во внеклеточной жидкости представлены в основном ионы натрия, хлора и гидрокарбоната. Натрий — основной катион и осмотически активный компонент внеклеточной жидкости, поэтому именно концентрация натрия определяет объем внеклеточной жидкости. Следовательно, изменения объема внеклеточной жидкости сопряжены с изменениями общего содержания натрия в организме, что, в свою очередь, определяется поступлением натрия в организм, его экскрецией почками и внепочечными потерями. Внеклеточная жидкость подразделяется на несколько типов: интерстициальную, внутрисосудистую и трансцеллюлярную.

Интерстициальная (межуточная) — жидкость, окружающая клетки. Интерстициальную жидкость можно рассматривать как ультрафильтрат плазмы. Через поры капиллярного эндотелия в норме проходит лишь незначительное количество белков плазмы, поэтому концентрация белка в интерстициальной жидкости

Часть I. ОБЩАЯ ПАТОФИЗИОЛОГИЯ

относительно низка (4 г/л), а общий состав электролитов соответствует составу плазмы. Белки, попавшие в интерстициальное пространство, возвращаются в сосудистое русло с лимфой. В норме очень небольшое количество интерстициальной жидкости находится в свободном состоянии. Большая часть интерстициальной воды химически связана с протеогликанами, формируя гель. Давление интерстициальной жидкости обычно отрицательное (около –5 мм рт. ст.). При увеличении объема интерстициальной жидкости ее давление повышается. Когда интерстициальное давление становится положительным, содержание свободной воды в геле быстро увеличивается, клинически это проявляется отеком. Количество интерстициальной жидкости у взрослых составляет примерно 11–12 л. По отношению к массе тела объем интерстициальной жидкости у новорожденного приблизительно в 2 раза больше, чем у взрослого. При кровопотере, а также при передозировке жидкости интерстициальная жидкость выступает в роли объемного буфера.

Внутрисосудистая жидкость — внутрисосудистая жидкость (плазма) отграничена эндотелиоцитами кровеносных сосудов. Большинство электролитов (в основном ионы небольшого размера) свободно проходят через эндотелий, чем объясняется поч- ти идентичный электролитный состав плазмы и интерстициальной жидкости. Вместе с тем плотные контакты эндотелиальных клеток препятствуют выходу белков плазмы за пределы сосудистого русла. Таким образом, белки плазмы (преимущественно альбумин) являются основным осмотически активным компонентом, обеспечивающим обмен жидкости между плазмой и интерстициальным пространством. В норме увеличение объема внеклеточной жидкости обеспечивается за счет пропорционального увеличения объема плазмы и интерстициальной жидкости. Таким образом, интерстициальное пространство служит своего рода компенсирующим резервуаром и для внутрисосудистого пространства.

Трансцеллюлярная жидкость содержится в специализированных полостях тела. К трансцеллюлярной жидкости относятся спинномозговая, перикардиальная, плевральная, синовиальная и внутриглазная, а также пищеварительные соки. В норме она составляет 2,4% массы тела. Объем трансцеллюлярной жидкости примерно 2 л. Эти жидкости являются секретами желез, находятся в различных полостях и существенно отличаются по хими-

ПРАКТИКУМ ПО ПАТОФИЗИОЛОГИИ

ческому составу. В течение суток выделяется до 8 л таких жидкостей, которые практически полностью подвергаются реабсорбции. Это равновесие может нарушаться, например, при кишечной непроходимости, когда большое количество жидкости и электролитов выводится в кишечную петлю.

ФАКТОРЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ДВИЖЕНИЕ ВОДЫ И РАСТВОРЕННЫХ ВЕЩЕСТВ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНЫ

Каждый жидкостный компартмент отделен селективно проницаемой мембраной, допускающей движение воды и некоторых растворенных в ней компонентов. К полупроницаемым мембранам организма относятся:

клеточные мембраны, разделяющие внутриклеточную и интерстициальную жидкость и состоящие из липидов и белка;

капиллярные мембраны, разделяющие внутрисосудистую и

интерстициальную жидкость;

эпителиальные мембраны, отделяющие внутрисосудистую и интерстициальную жидкость